Unité: Régulation Enzymatique des Activités Cellulaires

Responsable: Michel VERON

Les thématiques du laboratoire sont : (A) L'étude de la phosphorylation des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-virales, (B) l'étude des propriétés biochimiques de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-kB et (C) l'étude du mécanisme de la recombinaison chez les rétrovirus.

Phosphorylation des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-virales. Sarah gallois-montbrun et Dominique deville-bonne

Les analogues de nucléosides comme l'AZT qui figurent dans les protocoles thérapeutiques contre le SIDA et certaines maladies virales sont dispensés aux malades sous forme de nucléosides. Ils sont phosphorylés en dérivés triphosphate par des kinases cellulaires et deviennent des terminateurs de chaînes pour la transcriptase inverse virale. La Nucléoside Diphosphate (NDP) Kinase catalyse la dernière étape de cette voie d'activation. Depuis plusieurs années, nous étudions la réactivité de la NDP kinase humaine avec des analogues utilisés en thérapie (ddI, ddC, AZT, d4T). La phosphorylation des analogues qui sont dépourvus de groupe 3'OH sdur le sucre est beaucoup moins efficace que pour les nucléotides naturels. La combinaison des études des complexes au niveau biochimique et structural (coll. J. Janin, LEBS, Gif-sur-Yvette) a permis de proposer un modèle pour le mécanisme de la phosphorylation de ces agents thérapeutiques par la NDP kinase.

La ribavirine, un analogue de guanosine utilisé contre les virus à ARN, est active au niveau cellulaire sous forme triphosphate. Nous avons testé l'efficacité d'une série de dérivés modifiés sur le sucre afin de rechercher un analogue actif à faible dose dépourvu de cytotoxicité. Le dérivé dépourvu d'un hydroxyle en 2' réagit bien avec la NDP kinase et la transcriptase de l'hépatite C et semble une alternative intéressante à la ribavirine (coll. L. Mulard, Unité de Chimie Organique, IP et B. Canard, ESIL, CNRS Marseille).

Nous avons modifié la NDP kinase humaine au niveau de son site actif pour qu'elle devienne un meilleur agent de conversion des pro-drogues nucléosidiques au sein des cellules infectées. L'enzyme mutant L55H-N115S montre un gain de spécificité de plus de 300 fois pour les analogues substitués en 3'0H du sucre. Des expériences sur des cultures cellulaires ont pour but de déterminer si la présence de cette protéine mutante dans les cellules altère leur sensibilité aux analogues de nucléosides (coll. J. Balzarini, Rega Institut, Leuwen).

Nous étudions également le rôle de plusieurs autres enzymes dans la phosphorylation des nucléotides, et en particulier la PhosphoGlycerate Kinase et l'UMP-CMP Kinase humaine dont la structure cristallographique est en cours de résolution (coll. P. Alzari, IP).

Propriétés biochimiques de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-kB. François TRAINCARD, Emilie Vinolo, Elisabeth FONTAN, Jeanne CHIARAVALLI et Fabrice Agou

En réponse à une grande variété de stimuli comme les cytokines pro-inflammatoires (TNFα IL-1) ou les endotoxines (LPS), les cellules activent de nombreux gènes impliqués dans les réponses inflammatoires et immunitaires, l'oncogénèse et l'apoptose sous le contrôle du facteur de transcription NF-kB. L'activation de la voie est modulée par un complexe IKK constitué de protéines kinases et d'une protéine non catalytique NEMO (NF-kB Essential MOdulator). Nous tentons d'élucider le mécanisme moléculaire par lequel la protéine NEMO favorise la conversion des kinases sous une forme active (coll. A. Israël, Unité de Biologie Moléculaire de l'Expression Génique, IP).

Par l'étude des propriétés biochimiques d'une série de protéines mutantes délétées dans l'un ou l'autre des domaines composant NEMO, nous avons montré que la faculté de la protéine à former des oligomères, une condition nécessaire à sa fonction biologique, dépend d'un " domaine minimum d'oligomérisation " composé de deux coiled-coils (CC2 et LZ). Un modèle moléculaire a pu être proposé dans lequel les hélices provenant de trois polypeptides différents s'associent en un pseudo-hexamère formé d'hélices antiparallèles. Sur la base de ce modèle, des peptides synthétiques ont été produits dans le but de bloquer l'activation de la voie NF-kB en altérant l'état oligomérique de NEMO. L'un de ces peptides agit de manière spécifique sur des cellules en cultures, avec une IC50 de 3 μM, ce qui en fait un bon composé de départ pour rechercher des dérivés plus afins. Le même peptide induit l'apoptose sur des cellules cancéreuses, un résultat très encourageant pour la recherche de dérivés ayant des effets potentiels anti-cancéreux.

Des mutations dans la séquence de NEMO sont associées à deux maladies génétiques rares, EDA-ID et IP conduisant à des immunodéficiences chez l'homme (http://www.nfed.org/; http://imgen.bcm.tmc.edu/IPIF/). Nous avons commencé à étudier les propriétés biochimiques de la protéine pathogène A281G trouvée chez un malade atteint d'EDA-ID dont la mutation est localisée dans le domaine minimal d'oligomérisation de NEMO. Une meilleure compréhension des relations structure-fonction des protéines pathogènes pourrait permettre d'envisager de nouvelles approches thérapeutiques.

Etude des mécanismes de recombinaison génétique chez les rétrovirus. Roman Galetto, Véronique Giacomoni et Matteo Negroni

La recombinaison est la source majeure de variabilité génétique chez VIH et il est désormais établi qu'au moins 10 % des virus circulants sont générés par recombinaison entre sous-types viraux. La recombinaison a donc un grand impact sur l'évolution du virus. Chaque particule virale contient deux copies d'ARN génomique et la recombinaison est essentiellement générée par un changement de matrices entre ces deux ARN (transfert de brin) lors de la transcription inverse. Nous avons développé deux systèmes expérimentaux originaux, basés sur l'utilisation de marqueurs génétiques, pour étudier les mécanismes de la recombinaison générée pendant la transcription inverse in vitro et, récemment, dans des cellules infectées (ex vivo). Nous avons montré que la structure de l'ARN génomique est un déterminant majeur dans le processus de recombinaison et notamment que les structures en épingle à cheveux constituent des " points chauds " de recombinaison in vitro et ex vivo. In vitro, c'est la structure de l'ARN sur lequel la synthèse est transférée (ARN accepteur) qui constitue l'élément déterminant pour le processus. Nous avons aussi étudié le rôle de la nucléocapside (NC), la protéine virale la plus abondante du complexe de transcription inverse qui augmente la fréquence de recombinaison in vitro, grâce à son activité de chaperon d'ARN. Ces observations nous ont permis de formuler un modèle de la recombinaison dans lequel le transfert de brin est favorisé par un mécanisme ressemblant à la " migration de branche " qui à lieu pendant la recombinaison entre molécules d'ADN double brin. Les expériences en cours concernent la validation, à l'aide du système ex vivo, du modèle expérimental pour le transfert de brin dans des régions en épingle à cheveux que nous avons proposé sur la base des études in vitro. D'autre part, nous nous intéresserons aussi au rôle de la divergence de séquence entre souches parentales dans le processus de recombinaison en étudiant la recombinaison entre différents sous-types de VIH-1. Enfin, une collaboration avec le laboratoire d'E. Arts à Cleveland concerne la comparaison des populations virales produites en absence de toute pression de sélection (après un seul cycle infectieux) et celles observées lorsque plusieurs cycles sont possibles.

Mots-clés: NDP kinase, Analogues de nucléotides, Thérapies anti-virales, HIV, Recombinaison, Rétrovirus, Signal transduction, NEMO, NF-kB


Activity Reports 2003 - Institut Pasteur
filet

Page Top research Institut Pasteur homepage

If you have problems with this Web page, please write to rescom@pasteur.fr