Unité: Synthèse d'oligonucléotides à haut débit

Responsable: Gouyette Catherine

Nous synthétisons dans notre laboratoire des oligonucléotides principalement destinés aux puces à ADN de la plate-forme 2 de J.Y.Coppée pour les projets transcriptomes retenus par le comité de pilotage de la Génopole: Entamoeba histolytica, Bacillus anthracis, Plasmodium falciparum, Legionella pneumophila, Aspergillus fumigatus, Candida glabrata….

Nous avons faits à ce jour, en 2003, plus de 3000 oligos de 70 bases de long en moyenne.

Nous avons aussi synthétisé quelques oligos courts, purifiés par HPLC pour des études cristallographiques et spectroscopiques ainsi que quelques ARNi,dans le cadre d'une étude " Extinction de la multiplication de virus à ARN positif d'intérêt médical (entérovirus, virus de l'hépatite C) par de petits ARN interférants "

La plate-forme a été créée fin 2002 : il y avait un besoin croissant d'oligonucléotides longs pour les puces à ADN au sein de l'Institut Pasteur, et depuis janvier 2003 nous sommes installés dans le bâtiment de la Génopole.

C'est à ce moment que nous avons reçu tout notre équipement :

Le premier semestre a surtout été employé à mettre au point les différents matériels et à nous familiariser avec tous les nouveaux logiciels. Nous avons du modifier les programmes de synthèse standard des Mermade pour les adapter à des oligonucléotides longs. Les synthétiseurs Mermade IV sont conçus pour travailler en plaque 96 c'est à dire pour synthétiser en parallèle 96 oligonucléotides. Or nous faisons des oligos de 70 bases de long en général et il faut que les rendements de couplage de chaque base soient optimisés au maximum : par exemple avec un rendement de couplage moyen de 99% on obtient un rendement glogal de 50% pour un 70 mère alors que si le rendement moyen baisse à 98% ( ce qui est correct en faisant des séquences courtes) nous n'avons plus que 25% de rendement total du 70 mère (au lieu de 68% global avec un 20 mère dans les mêmes conditions).Il faut un peu plus de 40 heures au synthétiseur pour faire 96 oligos de 70 bases de long.

Il a fallu de même adapter les gradients de l'HPLC et les voltages de l'électrophorèse capillaire pour obtenir des élugrammes rapides mais néanmoins interprétables pour ces échantillons qui migrent plus difficilement dans des phases inverses ou des capillaires de gel. Nous utilisons ces deux techniques pour vérifier la qualité des oligos avant de les livrer. En général, sur une plaque 96 il y en a un peu moins d'une dizaine, maintenant, qui ne nous satisfont pas et nous les refaisons : un oligo peut paraître bon en électrophorèse capillaire mais de qualité insuffisante en HPLC, les critères de séparation n'étant pas les mêmes dans ces deux techniques.

Le spectromêtre de masse MALDI-TOF est très performant surtout pour des oligos relativement plus courts : il est très utilisé lors de nos synthèses d'oligos purifiés à grande échelle(mg) pour la cristallographie ou la spectroscopie ou lors de synthèses d'ARNi .

Mots-clés: synthèse d’oligonucléotides à haut débit


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