Unité: Programmation Moléculaire et Toxicologie Génétique - CNRS URA 1444 affiliée à l’INSERM

Responsable: CLÉMENT Jean-Marie

Notre unité a consacré son activité à quatre thèmes : 1) l'étude de l'organisation du chromosome d'Escherichia coli (séquences répétées), 2) l'étude du transporteur du maltose et des systèmes ABC (ATP Binding Cassette), 3) les super-intégrons bactériens qui associent des gènes mobiles du chromosome et 4) l'étude des agents génotoxiques capables de créer des dommages dans le matériel génétique des bactéries ou sur les souris transgéniques

Premier thème : BIME, séquences répétées et structure du génome.

(Jean-Marie Clément, Caroline Wilde).

Un nombre croissant de génomes bactériens entièrement séquencés est accessible dans les banques de données. La génomique fonctionnelle vise à caractériser la fonction des gènes et leur régulation, mais peu de travaux sont consacrés à l'organisation des chromosomes bactériens qui reste encore très mal connue.

Les séquences répétées, habituellement décrites chez les eucaryotes, sont également présentes en abondance chez les procaryotes. Nous avons dévouvert chez E. coli et d'autres entérobactéries voisines les BIME (Bacterial Interspersed Mosaic Elements), une famille de séquences répétées extragéniques. Nous y avons consacré une base de données (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/repet/index.html). La fonction des BIME reste à ce jour hypothétique. Nous avons émis l'idée que certaines d'entre elles permettraient de structurer le chromosome en s'associant à des protéines.

L'analyse de régions intergéniques homologues dans des isolats naturels d'E. coli a apporté deux résultats importants :

Chaque isolat possède une structure propre quant au type de séquence répétée occupant chaque région. Cette caractéristique a trouvé une application pour le typage des souches, en particulier dans le cas de Bacillus anthracis, l'agent causal de la maladie du charbon.

Dans certains isolats, IS1397, une nouvelle séquence d'insertion (IS), est insérée spécifiquement dans les Unités Palindromiques (UP), l'un des motifs de base constitutifs des BIME. Chez Klebsiella. pneumoniae, nous avons identifié une autre IS (ISKpn1) également spécifique des UP. Une telle spécificité de cible est tout à fait originale.

Nous avons sélectionné des événements de transposition d'IS1397 chez les entérobactéries (E. coli, Salmonella typhimurium, K. pneumoniae et Yersinia pestis). IS1397 s'intègre avec une spécificité quasi absolue au niveau des UP de type E. coli tandis qu'ISKpn1 semble spécifique des UP de type K. pneumoniae, dont le consensus est différent. Une étude menée chez Y. pestis, bactérie proche d'E. coli mais dépourvue d'UP, nous a indiqué que des cercles d'ADN composés du module transposable sont probablement des intermédiaires de transposition et suggère que la transposase d'IS1397 reconnait directement sa cible.

La comparaison des sites d'insertion d'IS1397 et d'ISKpn1 dans E. coli et K. pneumoniae ainsi que l'utilisation de systèmes génétiques adaptés à l'étude a transposition des IS sur des plasmides nous a permis de démontrer que la transposase de chaque IS est responsable du choix de la cible (UP de E. coli ou de K. pneumoniae) indépendamment de la nature des extrémités (répétitions inverses ou IR) des IS. Les deux Is ont donc évolué pour devenir spécifiques de leurs espèces. Leur dissémination vers d'autres entérobactéries nécessite une nouvelle adaptation qui implique des mutations permettant la reconnaissance de nouveaux types d'UP.

Deuxième thème : Le transporteur ABC du maltose et analyse phylogénétique des systèmes ABC(E. Dassa, P. Bouige, A. Charlery, O. Garcia, L. Goncalves, J. Mahaux, D. Murat, A. Pak)

Les systèmes ABC (ATP-Binding Cassette) constituent la plus grande famille de paralogues (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/abc/index.html). Ils permettent une très grande variété de processus cellulaires, principalement le transport de molécules à travers les membranes, mais aussi la transcription, la traduction, la protection de l'information génétique et leur régulation. Chez l'homme, 15 maladies génétiques graves (dont la mucoviscidose) sont causées par le dysfonctionnement de transporteurs ABC.

Nous poursuivons deux objectifs :

1) Protéines ABC orphelines

Un nombre important de protéines ABC n'ont pas de protéines membranaires associées connues. La fonction de quelques-unes a été identifiée (régulation de la traduction, de la transcription ou réparation de l'ADN). Chez Staphylococcus aureus, Vga est impliquée dans la résistance aux streptogramines. Une collaboration avec O. Chesneau vise à en comprendre le mécanisme . Quatre gènes d'Escherichia coli de la même famille, mais sans fonction connue, sont à l'étude (D. Murat, A. Pak, J. Mahaux L. Goncalves et E. Dassa). Le Programme tranversal de Recherches N°131 coordonné par E. Dassa étudie l'impact de l'inactivation de gènes homologues chez S. typhimurium, S.aureus, H. pylori, V. cholerae et Synechocystis.

2) Évolution des systèmes ABC

Nous avons constitué une base de données de séquences, de structures et de fonctions des systèmes ABC (ABCISSE). Elle regroupe plus de 5275 ATPases de type ABC et plus de 13013 gènes quand on y ajoute leurs partenaires. Un outil d'annotation automatisé permet de prédire la fonction (rarement étudiée et inconnue dans la moitié des cas), la spécificité de substrat et les partenaires des ATPases (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/abc/database.iphtml).

Nos analyses phylogénétiques répartissent les systèmes ABC en 3 classes qui recouvrent parfaitement les 3 classes fonctionnelles : les importateurs (exclusivement procaryotes), les exportateurs et les systèmes apparemment dépourvus de domaines transmembranaires qui seraient impliqués dans des phénomènes de régulation. L'analyse des systèmes ABC dans les génomes complets eukaryotes montre qu'ils ont conservé un jeu restreint de systèmes ABC en dépit de grandes différences dans la taille de leurs génomes. L'identification de 6 systèmes ABC typiquement procaryotes dans le génome nucléaire d'Arabidopsis thaliana suggère que les systèmes ABC eucaryotes descendraient essentiellement de bactéries symbiotiques, ancêtres des mitochondries et des chloroplastes (E. Dassa, A. Charlery, O. Garcia, P. Bouige).

Troisième thème : Super-intégrons

(Didier Mazel, Latefa Biskri, Gaëlle Demarre, Anne-Marie Guérout, Chiho Mashimo, Dean Rowe-Magnus)

Les transferts horizontaux de gènes jouent un rôle essentiel dans l'évolution des bactéries. On en trouve de nombreux exemples, allant de l'acquisition de nouvelles capacités métaboliques à l'expression de nouveaux facteurs de virulence chez les pathogènes. L'apparition et la dissémination des multi-résistances aux antibiotiques constatées ces dernières décennies posent de nombreux problèmes en santé publique. Elles illustrent dramatiquement l'importance de ces échanges génétiques.

Une classe particulière d'éléments mobiles, les intégrons, a joué un rôle primordial dans ce processus chez les bactéries à Gram négatif. Les intégrons constituent un véritable système de génie génétique naturel. Grâce à l'activité d'une intégrase spécifique de sites de recombinaison associés à chaque cassette, ils permettant la capture, l'expression et la dissémination d'ADN exogène.

Nous avons découvert une catégorie moins spécialisée d'intégrons, les super-intégrons, qui regroupent des dizaines de cassettes sur le chromosome de plusieurs γ-protéobactéries (Vibrio, Shewanella, Xanthomonas, Pseudomonas...). Les relations phylogénétiques entre les intégrases des super-intégrons indiquent qu'ils dérivent d'un intégron hébergé par l'ancêtre commun de ces bactéries. Les super-intégrons ont ainsi pu jouer un rôle de machine évolutive pendant des centaines de millions d'années. Actuellement, ils maintiennent un réservoir considérable de fonctions adaptatives variées (métabolisme, résistances, détoxification, virulence...). Ils semblent capables de capturer des gènes d'origine extrêmement diverse, puisque certains n'ont pour l'instant d'homologues que chez les eucaryotes, les archaebactéries ou les virus. Nos études suggèrent que les super-intégrons sont à l'origine des intégrons multi-résistants. Nos travaux portent sur l'inventaire de ces éléments et l'analyse des fonctions qu'ils hébergent, sur l'expression des gènes à l'intérieur de ces structures et sur les mécanismes de recombinaison et de genèse des cassettes (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/integ/index.html)

Quatrième thème. Effets mutagènes d'agents de l'environnement

(Philippe Quillardet, Marie Ange Rouffaud)

Nous participons à la démarche préventive qui consiste à détecter dans l'environnement les génotoxiques, produits capables de créer des mutations susceptibles d'entraîner des cancers chez l'homme. Nous avons créé le SOS-chromotest, un test colorimétrique bactérien pour le dépistage rapide des génotoxiques qui a été validé sur un grand nombre de substances (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/toxic/index.html).

1) Mécanisme d'action des nitrofurannes chez Escherichia coli

La nitrofurantoine et le nifuroxazide, deux molécules mutagènes chez les bactéries, sont couramment prescrites contre les infections urinaires et gastrointestinales. Le R7000 (de la même famille des 5-nitrofurannes) est un des mutagènes les plus puissants pour les bactéries. Nous avons analysé les adduits que le R7000 crée massivement (essentiellement sur les guanines) et les mutations qui en résultent (substitutions G:C-›T:A et délétions d'une paire G:C). Une activation métabolique par des nitroréductases est nécessaire et entraîne un stress oxydatif, SoxRS-dépendant, qui pourrait renforcer la génotoxicité des nitrofurannes.

2) Mécanisme d'action des nitrofurannes chez la souris

Les effets des nitrofurannes ont été étudiés dans un modèle animal (souris transgéniques "Big Blue" hébergeant un gène rapporteur bactérien) pour évaluer les conséquences possibles de l'utilisation des nitrofurannes chez l'homme. L'injection du R7000 par voie intrapéritonéale induit essentiellement des mutations au niveau du petit intestin, du caecum et du colon, cibles de l'action thérapeutique des nitrofurannes. Ces mutations, et donc probablement le mode d'action du R7000, sont très similaires chez la souris et chez E. coli. L'administration orale de R7000 ou de nitrofurantoine entraîne respectivement des mutations au niveau de l'estomac ou des reins. Aucune activité mutagène n'est par contre détectée avec le nifuroxazide.

3) Génotoxiques et transcriptome

Le transcriptome d'Escherichia coli nous permet d'identifier les gènes induits ou réprimés par une grande variété d'agents génotoxiques (en particulier dans les polluants du milieu naturel) et de définir une "signature" pour chacun d'eux. Leur action sur le métabolisme, leur activation et sur les réponses réparatrices pourra être précisé ainsi que les propriétés d'ORF dont la fonction est actuellement inconnue. D'autre part, la construction de souches bactériennes portant des fusions entre des gènes diagnostiques et un gène rapporteur pourrait être à la base d'un test de dépistage rapide des agents génotoxiques de l'environnement.

Mots-clés: Structure du Chromosome, Superintégrons, Plasticité du Génome, systèmes ABC, Toxicologie Génétique, Cancerognèse


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