Unité: Pathogénie Microbienne Moléculaire

Responsable: Philippe SANSONETTI

Notre unité étudie les bases moléculaires de la rupture, de l'invasion et de la destruction inflammatoire de la barrière intestinale par les bactéries invasives et les mécanismes de défense et de protection contre ces infections. Notre modèle est Shigella, l'agent responsable de la dysenterie bacillaire. Nous appliquons une combinaison de génétique moléculaire, génomique fonctionnelle, biologie cellulaire, médecine expérimentale et immunologie. Nous identifions les gènes microbiens, la régulation de leur expression et leurs produits modifiant le comportement des cellules épithéliales ou phagocytaires de l'hôte. La signalisation conduit à l'internalisation du microorganisme, son mouvement intracellulaire et sa dissémination dans l'épithélium. La présence du microorganisme au sein de la cellule épithéliale et son interaction avec les cellules phagocytaires induisent une cascade de signalisations pro-inflammatoires causant une rupture de la barrière épithéliale intestinale et son éventuelle destruction. Nous développons des approches innovantes d'imagerie cellulaire et tissulaire et d'analyse transcriptomique afin de détecter, analyser et suivre infection et inflammation. L'influence de cette réponse immunitaire innée sur la réponse immunitaire spécifique, ainsi que les mécanismes inducteurs et effecteurs de cette réponse spécifique sont aussi étudiées. Ces études fondamentales sont appliquées au développement de candidats vaccins contre la dysenterie bacillaire. Des essais cliniques de phase 1 et 2 sont actuellement en cours.

Génétique du phénotype invasif de Shigella flexneri

Chercheur statutaire : Claude Parsot. Chercheurs post-doctorants : Maria Mavris, Kaïs Jamoussi, Dong Wong Kim. Doctorants: Christophe Penno. Technicienne : Elisabeth Ageron.

Les déterminants de l'entrée et de la dissémination des bactéries dans les cellules épithéliales sont codés par un plasmide de 213 kb, pWR100, dont la séquence et l'annotation ont été réalisées, en collaboration avec le Laboratoire de Génomique des Micro-organismes Pathogènes. Ce plasmide contient, en particulier, une région de 30 kb qui spécifie un appareil de sécrétion de type III (l'appareil Mxi-Spa), des protéines sécrétées par cet appareil (les protéines IpaA-D, IpgB et IpgD) et des chaperons cytoplasmiques (IpgC, chaperon de IpaB et IpaC, et IpgE, chaperon de IpgD). L'appareil de sécrétion est activé lors du contact de la bactérie avec des cellules eucaryotes, ce qui induit la sécrétion des protéines IpaA-D et IpgB et IpgD. Le plasmide spécifie également une vingtaine d'autres protéines sécrétées par l'appareil Mxi-Spa (les protéines Osp et IpaH), certaines de ces protéines n'étant produites qu'en conditions de sécrétion.

Les travaux effectués portent sur trois aspects principaux : 1) Le rôle des protéines Osp dans le pouvoir pathogène de S. flexneri, abordé en utilisant une approche génétique consistant à inactiver systématiquement les gènes correspondants et à caractériser le phénotype des mutants in vitro et in vivo. Deux mutants ont pu être caractérisés de manière intéressante OspF a une pathogénicité diminue in vivo alors que OspG est hypervirulent. 2) Les interactions entre protéines sécrétées et chaperons, analysées en utilisant la technique du double hybride dans la levure, des méthodes de copurification dans S. flexneri et une analyse structurale cristallographique. Nous avons ainsi identifié les sites d'interaction de IpgC sur IpaB et IpaC et mis en évidence un nouveau chaperon, Spa15, qui est associé dans le cytoplasme aux protéines IpaA, IpgB et OspC. L'analyse structurale de ces chaperons est en cours; 3) Le mécanisme du contrôle de la transcription des gènes osp et ipaH par l'activité de sécrétion a été élucidé et met en oeuvre un activitateur de transcription de la famille AraC, MxiE, dont l'activité dépend du chaperon IpgC et de l'existence d'une séquence opératrice consensus en amont de ces gènes.

Ces résultats fournissent un schéma sur la " logique " de fonctionnement de la voie de sécrétion de type III de S. flexneri. A 37°C, l'appareil Mxi-Spa est produit et assemblé sous une forme inactive. Les protéines IpaA-D et IpgB et IpgD, effecteurs de l'entrée des bactéries, sont également produites et stockées dans le cytoplasme de la bactérie, la plupart en association avec un chaperon spécifique. L'appareil de sécrétion est activé au contact de la bactérie avec la cellule, permettant la libération des invasines. Le chaperon IpgC est alors capable d'activer le régulateur MxiE, ce qui conduit à la transcription des gènes spécifiant une deuxième vague d'effecteurs, dont le rôle reste à analyser.

Figure 1 = Le plasmide de virulence pWR100 de 214 kb de Shigella flexneri.

Molécules et signaux impliqués dans l'entrée de Shigella dans les cellules épithéliales et dans le passage de cellule à cellule.

Chercheur statutaire : Guy Tran Van Nhieu. Chercheurs post-doctorants : Nalini Ramarao, Caroline Clair. Doctorante : Laurence Bougnères. Technicienne : Joëlle Mounier.

Nous étudions la cascade de signalisation qui cause les remaniements du cytosquelette cellulaire responsables de la formation du foyer de macropinocytose qui amène l'internalisation de Shigella dans les cellules épithéliales. Nous analysons plus particulièrement le rôle des petites GTPases de la famille Rho, Cdc42 et Rac et l'activation de la tyrosine kinase p60c-src. Ces deux voies de signalisation sont engagées simultanément durant l'entrée de Shigella dans la cellule, et nous avons récemment montré que la protéine IpaC, qui s'insère dans la membrane de la cellule épithéliale infectée, participe directement à l'activation de ces voies. Cdc42 et Rac sont responsables de la polymérisation de l'actine et de la formation des filopodes et lamellipodes qui entourent le corps bactérien, induisant son internalisation par la cellule. Les modalités de leur activation par IpaC sont en cours d'analyse. La polymérisation de l'actine en aval de ces GTPases, à distance du site d'interaction entre le corps bactérien et la membrane cellulaire fait intervenir la tyrosine phosphorylation de la cortactine par p60c-src, son recrutement à la membrane et l'activation du complexe Arp2/3.

Nous avons par ailleurs démontré le rôle essentiel joué par les connexines dans le passage de cellule à cellule de Shigella. L'ouverture des hémi-canaux des cellules infectées entraine la libération d'ATP qui, par un effet paracrine et via le récepteur purinergique, entraine la survenue de flux calciques itératifs au sein des cellules adjacentes non infectées. Ce mécanisme original de signalisation accroit considérablement le niveau de permissivité de ces cellules à l'infection par Shigella, qu'il s'agisse d'entrée ou de passage de cellule à cellule. (Figure 2 :Induction de réponses calciques dans des cellules HeLa exprimant la connexine 26 durant l'invasion par Shigella.

Bases moléculaires et cellulaires de la rupture, de l'invasion et de la destruction inflammatoire de la barrière épithéliale intestinale par Shigella

Chercheurs statutaires : Philippe Sansonetti, Laurence Arbibe, Régis Tournebize. Chercheurs post-doctoraux : Stephen Girardin, Irit Paz. Doctorant : Meng-Tsung Tien. Ingénieurs : Monique Singer, Thierry Pédron.

Dans le cadre de notre projet visant à comprendre comment Shigella assure l'invasion et la destruction inflammatoire de la barrière intestinale, nous avons confirmé le rôle essentiel joué par la cellule épithéliale intestinale elle-même dans ce processus où l'IL-8, l'IL-1β et le TNFα jouent un rôle clé. La stratégie utilisée combine des approches in vitro et in vivo. En collaboration avec le groupe de Dana Philpott, nous avons démontré qu'une protéine cytosolique, Nod1/Card4, agit comme senseur intracellulaire du Peptidoglycane (PGN) des bactéries à Gram -. Chez le macrophage, son homologue, Nod2/Card15 perçoit le PGN en général et le Muramyl-dipeptide en particulier. Ces résultats, au delà de leur intérêt dans la compréhension de la shigellose, sont prometteurs quant à la compréhension de la physiopathologie des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin comme la maladie de Crohn et la Rectocolite hémorragique. Ce système original de signalisation représente l'équivalent intracellulaire du système de signalisation trans-membranaire des Récepteurs " Toll-Like " (TLR). L'activation par oligomérisation de Nod1 en présence de PGN, via RICK, active les voies NF-kB et Jun-terminal kinase (JNK), déclenchant ainsi les propriétés pro-inflammatoires de la cellule infectée. Cette propriété est résumée par l'activation de la transcription et la production massive d'IL-8. Nous avons en plus étudié le transcriptome des cellules intestinales humaines infectées par Shigella par le système AFFYMETRIX et avons défini un profil transcriptionnel confirmant l'orientation essentiellement pro-inflammatoire de la signalisation induite par l'invasion. Ce profil a été confirmé in vivo par l'analyse transcritpionnelle de tissu intestinal humain transfecté dans des souris Sci (Collaboration avec le groupe de Sam Stanley, Washington Universiy). Nous avons, sur ces bases, développé avec le groupe de Jean-Yves Coppée (Génopole de l'Institut Pasteur), un " macroarray " d'un millier de gènes humains permettant en routine une analyse globale du transcriptome des cellules infectées. Il convient maintenant de relier les observations in vitro et in vivo. Nous développons pour ce faire des méthodes d'analyse en temps réel des processus infectieux basées sur l'IRM et la microscopie intravitale ainsi que des modèles murins, y compris transgéniques, d'inflammation de l'intestin.

Immunité intestinale spécifique au cours de la dysenterie bacillaire.

Chercheur statutaire : Armelle Phalipon. Chercheur post-doctoral : Maria-Isabel Fernandez-Martinez. Doctorant : Joao Gamelas. Technicienne : Audrey Thuizat.

Nous étudions les effecteurs de l'immunité protectrice au cours de la primo-infection et lors d'une ré-infection, ainsi que l'influence de la réponse innée inflammatoire sur la mise en place de l'immunité spécifique. En collaboration avec James Di Santo, nous avons montré, dans un modèle murin, que les lymphocytes NK et les lymphocytes TCD4+(α /α ) contribuent l'un comme l'autre à l'éradication de la primo-infection via la production d'interféron γ ( INF-γ ). Aux étapes très précoces de l'infection, Shigella semble moduler la production d'INF-γ . Ceci nous amène à étudier le rôle de la modulation de la réponse innée dans la mise en place de l'immunité humorale protectrice.

La réponse humorale dirigée contre la partie polyosidique du LPS (Ag-O) est essentielle dans la protection contre une ré-infection. Nous avons montré que la réponse médiée par des anticorps de type IgG spécifiques de l'Ag-O peut contribuer à la protection si cette réponse est initiée au niveau local, assurant ainsi la présence des effecteurs au site d'infection. Concernant les IgA sécrétoires (S-IgA) requises pour la protection de la muqueuse, nous avons montré, en collaboration avec Blaise Corthésy, que le composant sécrétoire est directement impliqué dans cette fonction de protection en assurant via ses résidus glycosylés une localisation tissulaire appropriée de l'IgA pour une fonction d'exclusion immune optimale. Par ailleurs, nous avons montré que le LPS bactérien absorbé par le pôle apical des cellules épithéliales activait NF-κ B selon une cinétique plus lente que la bactérie invasive. Cette activation est neutralisée par une IgA monoclonale anti-LPS, qui au cours de sa transcytose, intercepte le produit bactérien. Ceci démontre un rôle anti-inflammatoire potentiel tout à fait original pour les S-IgA. Ainsi, la protection médiée par les IgA sécrétoires anti-LPS semble s'effectuer par un double mécanisme : exclusion immune des bactéries en surface de l'épithélium et neutralisation intracellulaire d'un produit bactérien pro-inflammatoire.

Figure 3 : A specific dimeric IgA interferes with NF-κ B translocation induced by intracellular S. flexneri 5a LPS.

Vers un vaccin vivant oral atténué contre la shigellose.

Dans le cadre d'une collaboration avec le Walter Reed Army Institute of Research aux USA et l'ICDDR,B au Bangladesh, nous continuons les essais cliniques de phase I et II de la souche SC602 de S. flexneri 2a. Avec le soutien de la DGA, nous avons débuté une étude de phase I de SC599, une souche candidate vaccinale atténuée de S. dysenteriae I. Par ailleurs, afin de limiter au maximum les effets secondaires, notre objectif est d'arriver à un vaccin pentavalent comportant 3 sérotypes de S. flexneri, S. dysenteriae1 et S. sonnei. En parallèle, nous développons une approche de vaccin " sous-unité " basé sur la synthèse chimique des antigènes polyosidiques.

Légendes des photos :

Photo 1: Le plasmide de virulence pWR100 de 214 kb de Shigella flexneri.

Photo 2: Induction de réponses calciques dans des cellules HeLa exprimant la connexine 26 durant l'invasion par Shigella.

Des cellules HeLa exprimant la connexine 26 ont été chargées avec la sonde calcique fluorescente Fura-2 et infectées par Shigella. La formation de feuillets membranaires induits au site d'entrée de la bactérie a été suivie par microcopie à contraste de phase en " time-lapse ", de manière simultanée avec les variations d'émission de fluorescence du Fura-2 avec des excitations à 340 nm et 380 nm. Panneaux du haut : microscopie à contraste de phase : les flèches indiquent les sites d'invasion de Shigella. Panneaux du milieu et du bas : images du même champ correspondant au ratio des images obtenues à une excitation de 340 et 380 nm : les flèches indiquent les cellules présentant des oscillations du Ca2+ intracellulaire. Le temps écoulé est indiqué en secondes.

Photo 3: A specific dimeric IgA interferes with NF-κ B translocation induced by intracellular S. flexneri 5a LPS

Confocal microscopy images at the focal level corresponding to the nucleus of murine polarized intestinal epithelial cells pretreated with α-S. flexneri 5a LPS dIgA for 6 hr followed by addition of S. flexneri 5a LPS for 2 hr. In LPS 5a (blue) positive cells (a), in which NF-κ B p65 subunit (red) is translocated to the nucleus, note the intense red colour in the nucleus and the absence of dIgAC5 (in green). In contrast, NF-κ B p65 subunit is not translocated in LPS 5a (blue) and dIgAC5 positive (green) double psitive cells (b). Scale bars: 5 microns

Mots-clés: Shigella, épithelium intestinal, invasion, inflammation, réponse immunitaire, vaccin


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