Unité: Neuro-immunologie Virale

Responsable: Monique Lafon

Le thème de recherche consiste à étudier les interactions qui s'établissent entre les virus neurotropes, le système immunitaire et le système nerveux (SN). Cette approche devrait permettre de développer des stratégies thérapeutiques antivirales adaptées aux infections du SN ainsi que d'identifier des gènes favorisant la survie des neurones.

Nous faisons l'hypothèse que, pour mener à bien leur cycle viral, les virus neurotropes ont sélectionné des mécanismes qui préservent l'intégrité des neurones qu'ils infectent. Les virus neurotropes sur-exprimeraient ainsi des molécules qui favorisent la survie du neurone et/ou lui permettent d'échapper à la réponse immunitaire. Ainsi les virus neurotropes bien adaptés au système nerveux induirait une immuno-subversion, obtenue soit localement par le renforcement du privilège immun de ce système soit en périphérie en immuno-supressant le système immunitaire.

Echapper à l'apoptose ferait aussi partie des stratégies suivies par les virus neurotropes pathogènes. Ceci pourrait être intrinsèquement modulé par les protéines virales ou par la sécrétion de facteurs protecteurs du neurone. La préservation de l'intégrité des neurones qu'ils infectent leur permettrait d'assurer avec succès leur cheminement au travers du SN et leur transmission à un nouvel hôte. Ce mécanisme aurait été retenu par des virus extrêmement adaptés au SN comme le virus de la rage qui, après son inoculation par morsure au niveau d'un muscle, doit impérativement atteindre les glandes salivaires pour être excrété et recommencer un cycle dans un nouvel hôte.

Nous utilisons le virus de la rage comme modèle d'infection du SN de la souris.

Nous disposons au laboratoire de souches de pathogénicité atténuée, peu adaptées au système nerveux qui ne causent qu'une infection transitoire et abortive (PV) et aussi de souches (CVS) qui sont au contraire fortement pathogènes et neuro invasives. Apres injection dans le muscle de la patte arrière, les virus des deux souches gagnent par les nerfs le SNC et progressant de neurones en neurones, ils infectent de façon similaire la moelle épinière. Par la suite, la progression des deux souches est tout à fait différente : l'infection par la souche de pathogénicité atténuée PV n'atteint en effet pas le cerveau ou transitoirement le cervelet, et les souris survivent, alors que la souche pathogène CVS envahit la totalité du cerveau et induit la mort de l'animal

Rôle de FasL dans l'immuno-subversion (Leïla Baloul)

Nous avons comparé la cinétique de migration des lymphocytes T et l'expression de FasL dans le système nerveux de souris immunocompétentes infectées par CVS ou PV.

Nous avons établi que malgré une migration similaire de lymphocytes dans le SNC des souris, leur devenir à partir du jour 7 différait sensiblement selon le type d'infection. Ainsi, les lymphocytes continuaient à envahir le SNC des souris infectées par la souche virale qui était contrôlée par la réponse immunitaire, alors qu'ils disparaissait du SNC avec la souche pathogène. Nous avons montré que les lymphocytes disparaissaient par apoptose. Par PCR en temps réel, et immunohistochimie, nous avons établi que cette apoptose était concomitante à l'expression de FasL dans les extraits du système nerveux. Ni l'augmentation d'apoptose, ni celle de l'expression de FasL ne survenaient lors de l'infection par le virus faiblement pathogène (PV). Ceci suggérait fortement que la pathogénicité pouvait être liée à la capacité du virus à induire l'expression de FasL. Nous avons testé l'hypothèse en infectant des souris mutantes n'exprimant pas FasL (souris gld). Nous avons observé que l'infection était effectivement moins sévère chez les souris gld, que chez les souris normales (mortalité réduite et délai de deux jours dans l'apparition des paralysies).

L'ensemble de ces résultats établit que la capacité du virus à moduler FasL est un facteur essentiel de pathogénicité pour le virus de la rage. Ils suggèrent que ce mécanisme aurait été sélectionné par le virus pathogène pour désamorcer la protection conférée par les lymphocytes qui parviennent à éliminer le virus non pathogène qui lui ne module pas l'expression de FasL. (Lafon, 2004).

C'est à notre connaissance la première démonstration qu'un virus neurotrope est capable de moduler l'expression de FasL au niveau du système nerveux et de renforcer le privilège immun.

La pathogénicité d'une souche de virus de rage est inversement corrélée à sa capacité à induire l'apoptose des cellules infectées (Maria-Isabel Thoulouze, Stéphanie Lay, Leïla Baloul, Mireille Lafage, Christophe Préhaud).

Les souches de virus qui infectent le système nerveux, (CVS , PV) de la souris et se propagent de la moelle épinière au cerveau après injection en périphérie ne sont pas capables d'induire l'apoptose, ni in vivo, ni in vitro l'apoptose ni des cellules de la lignée lymphoblastoide humaine Jurkat ni de celles de neuroblastome humain (SK-N-SH) (Baloul and Lafon, 2003). Par contre, les souches atténuées qui ont perdu leur capacité à se propager dans le système nerveux, (ERA, SAG, SN10) et qui sont des prototypes de souches de vaccin vivant oral, induisent in vitro l'apoptose. (Thoulouze et al., 1997, 2003a, 2003b, Prehaud et al, 2003, Lay et al, 2003).

L'induction d'apoptose par la souche ERA se caractérise par l'exposition de phosphatidylserine à la surface des cellules et par la fragmentation nucléaire. L'apoptose rabique dans les cellules Jurkat fait intervenir essentiellement l'activation des caspases mais aussi des mécanismes indépendant comme la translocation de l'AIF (apoptosis inducing factor) (Thoulouze et al, 2003a et b).L'entrée en apoptose s'accompagne d'une accumulation et d'une répartition particulière de protéines virales, protéines G et N, dans le cytoplasme.

Seule la protéine G de ERA, souche de virus atténuée est pro-apoptotique (Christophe Préhaud, Stéphanie Lay, en collaboration avec B. Dietzschold, Jefferson Institute, Philadelphia, USA)

Puisque les deux virus ERA et CVS infectent tous deux les lymphocytes, mais que l'apoptose n'est observée qu'avec la souche ERA, nous avons testé l'hypothèse que l'entrée en apoptose pouvait être liée à la nature intrinsèque des protéines de la souche ERA.

La mise au point d'un système d'expression des protéines G et N du virus de la rage inductible par la Doxycycline dans les cellules Jurkat nous a permis d' établir que seule l'expression de la protéine G-ERA dans les lymphocytes cibles Jurkat rtTA induit l'apoptose. L'utilisation de virus recombinants obtenus par génétique inverse, dans lesquels la G-ERA pro-apoptotique a été remplacée par la G de la souche non apoptotique, (B. Dietzschold, USA) a permis de montrer qu'aucune des trois autres protéines virales, M, P, ou L ,n'était impliquée dans l'apoptose induite par ERA aussi bien dans les cellules lymphoblastoides que les neurobastomes humains. L'induction de l'apoptose s'accompagne de l'accumulation de la G-ERA au niveau de la membrane plasmique (Prehaud et al, 2003, Lay et al, 2003). Des experiences de FRAP (fluorescent recovery after photobleaching, collaboration avec P Roux du Centre d'Imagerie Dynamique de l'IP) indique que l'entrée en apoptose s'accompagne de modifications de la fluidité membranaire.

Application de la propriété pro-apoptotique de G-ERA à la vaccinologie (Christophe Préhaud, Françoise Mégret, Mireille Lafage en collaboration avec Christophe Batejat et Nicolas Escriou, Unité de Génétique Moléculaire des Virus Respiratoires de l'Institut Pasteur)

Nous cherchons à démontrer in vivo dans un modèle de vaccination hétérologue que la glycoprotéine pro-apoptotique du virus de la rage peut améliorer une réponse vaccinale de type B (anticorps). Ceci est fondé sur la propriété adjuvante des corps apoptotiques. (Berard et al, 2000) et protectrice (Paczesny, et al, 2001).

Nous avons choisi d'étudier l'amélioration de la réponse anticorps dirigée contre le déterminant antigénique majeur du virus de la grippe (hemagglutinine : HA). Pour cela le gène de la glycoprotéine G-ERA a été introduit dans un vecteur viral de la vaccine (vaccinia) et des cellules lymphoblastoides (EL-4) de souris ont eté infectées ou co-infectées par le virus recombinant la G-ERA et par le virus recombinant la HA . La réponse humorale dirigée contre la HA a été comparée entre groupes de souris C57bl6 ayant reçu différentes combinaisons de cellules infectées ou co-infectées. Les résultats indiquent que l'expression de la G-ERA responsable de la fragmentation par apoptose de cellules présentant l'antigène du virus de la grippe (HA) améliore sensiblement la réponse au vaccin grippe. Cet effet est annulé lorsque la production de corps apoptotiques par la G-ERA est bloquée en ajoutant un peptide inhibiteur de l'activation des caspases (Z-VAD) (Préhaud et al, en préparation).

La G-ERA par ses propriétés pro-apoptotiques constituerait donc un facteur d'amélioration des vaccins vivants.

(Brevet IP : wo 03/048198 A2)

Analyse différentielle des transcriptomes de neurones humains post-mitotiques NT2-N (Christophe Préhaud, Françoise Mégret)

Le projet de l'unité consiste à identifier les gènes qui favorisent la survie des neurones. Les virus, parasites remarquablement bien adaptés à leur hôte, ont sélectionné des stratégies qui préservent l'accomplissement de leur cycle viral. Ils sont ainsi capables de se proteger contre l ‘apoptose cellulaire qui risque de mettre fin prématurement à la production de nouvelles particules virales. Mais il semblerait aussi qu'il soient aussi capables d'augmenter la survie des cellules qu'ils infectent. C'est le cas en particulier du virus de la rage dont la pathogencité est liée à sa capacité à prolonger la survie des neurones qu'il infecte.

En utilisant le virus de la rage comme modèle d'infection virale du système nerveux, nous avons démontré que ce virus maintient en vie les neurones humains non seulement en les preservant de l'entrée en apoptose (Lafon et al, 2003, Lay et al, 2003 Thoulouze et al,1997, 2003) mais aussi en augmentant leur survie (test de respiration des mitochondries).

Notre démarche a consisté à comparer les transcriptomes de neurones humains après infection par des souches de rage de différentes pathogénicités.Nous avons pour cela infecté des cultures pures de neurones humains post-mitotiques (NT2-N) par deux virus de rage de pathogénicité différentes : un virus très pathogène qui induit la survie des neurones et un virus non-pathogène qui induit l'apoptose.

Les cellules NT2 dérivent d'un clone du teratocarcinome humain Tera-2.Elles ont la particularité de se différencier en cellules neuronales fonctionnelles (NT2-N) en présence d'acide rétinoïque (Andrews et al, 1984, Pleasure et al, 1992, Guillemain et al, 2000). La standardisation du protocole de culture (incubations séquentielles en acide rétinoïque et inhibiteur de mitose, l'utilisation de support adaptés) permettant la différenciation des NT2-N est le fruit de plusieurs études. A la différence des cellules de pheochromocytoma de rat (PC12) traitées au NGF, les cellules NT2-N acquièrent un phénotype de neurones différenciés post-mitotiques irréversible, caractérisé par l'expression de marqueurs de neurones matures comme MAP-2, βtubulin, synaptophysine, neurofilaments et tau. Les cellules NT2-N établissent des contacts synaptiques classiques intercellulaires et des contacts fonctionnels avec des astrocytes en co-culture.

Les ARN ont été extraits de plusieurs préparations et soumis pour analyse différentielle des transcriptomes par la techniques de biopuces humaines (Génopole de l'Université Louis Pasteur, Strasbourg).

L'analyse intégrative et comparative des transcriptomes de neurones humains post-mitotiques (NT2-N) induits par l'infection de souches de virus de pathogénicité différente a été réalisée avec les deux biopuces Affymetrix (puces humaines U133A et U133B) qui couvrent l'intégrité du genome). Elle nous a permis d'identifier sept gènes d'interet pouvant etre impliqués dans la pathogénicté virale et la survie des neurones. La surexpression de ces gènes dans les NT2-N au cours de l'infection a été vérifiée par PCR en temps réel.

Leur capacité à moduler la survie des neurones suite au stress-viro-induit sera maintenant étudiée dans des systèmes de transfection et de sur-expression des protéines considérées. Les modèles murins de souris déficientes ou sur-exprimant le gène candidat seront disponibles, ainsi que les techniques d'invalidation de l'expression des gènes (siARN) permettront de valider l'implication de ces gènes dans la pahogénicité des virus neurotropes et la survie neuronale.

Photos :

I : Neurones humains post-mitotiques (NT2-N) en culture.

II : Immunopotentiation d'un vaccin vivant par l'induction de corps apoptotiques. Une cellule de la lignée lymphoblastoide (EL-4) de souris co-exprimant un antigène vaccinal (hemagglutinine du virus de la grippe, en rouge) entre en apoptose (noyaux fragmentés en bleu) car elle exprime le facteur pro-apoptotique (G-ERA en vert)

Mots-clés: neurone, apoptose, rage,HSV-1, NT2-N, AIF, neuroblastome, biopuces, virologie, neurologie, immunologie


Activity Reports 2003 - Institut Pasteur
filet

Page Top research Institut Pasteur homepage

If you have problems with this Web page, please write to rescom@pasteur.fr