Unité: Neisseria

Responsable: Jean-Michel ALONSO

Les principaux thèmes de recherche de l'unité des Neisseria, Centre National de Référence des Méningocoques, sont la pathogénie et l'épidémiologie moléculaires des infections à Neisseria meningitidis, incluant les typages moléculaires des souches d'infections invasives. Les recherches expérimentales sont centrées sur la caractérisation des facteurs de virulence et sur l'étude des altérations génétiques impliquées dans la résistance aux α -lactamines.

1. Pathogénie moléculaire des infections meningococciques. Neisseria meningitidis (Nm) est le plus souvent un commensal du rhinopharynx de l'homme. Une infection invasive survient lorsque les bactéries adhérant à l'épithélium respiratoire envahissent le sang. Elles peuvent ensuite franchir la barrière hémato-méningée pour provoquer une méningite ou atteindre les articulations ou le péricarde. L'adhésion de Nm aux cellules épithéliales et endothéliales est une étape cruciale du processus infectieux qui implique des interactions complexes entre bactéries et cellules-cibles. Cette interaction débute par une adhésion dite initiale (localisée) et se poursuit par l'adhésion intime. La protéine PilC1 est l'adhésine majeure, et l'expression de pilC1 est induite transitoirement par l'adhésion initiale. Cette induction dépend d'un site de transcription localisé dans l'élément de régulation de contact de Neisseria (CREN) dans la région promotrice de pilC1. Un autre gène, crgA, codant la protéine CrgA, un nouveau régulateur transcriptionnel de type LysR est également induit selon un processus CREN-dépendant. L'expression de structures de la surface bactérienne impliquées dans l'adhésion telles que les pili et la capsule, est modulée par CrgA, qui intervient dans la régulation coordonnée des gènes pilC1, pilE, sia et crgA pour permettre la transition de l'adhésion initiale vers l'adhésion intime.

1.2.Modèle expérimental de méningococcémie. Sur la base d'études épidémiologiques démontrant l'association entre des pics d'épidémies de grippe et les méningococcies, nous avons développé un modèle murin d'infections séquentielles par le virus influenza A (IAV) puis Nm. La primo-infection IAV déclenche une phase transitoire de susceptibilité des souris à une épreuve infectieuse par Nm qui provoque une pneumonie et une bactériémie. Des examens histologiques séquentiels révèlent des lésions localisées de l'épithélium bronchique au niveau desquelles les bactéries traversent l'épithélium. Une intense pneumonie se constitue montrant une infiltration de polynucléaires neutrophiles et des méningocoques intra-leucocytaires. Une infiltration périvasculaire de leucocytes et de méningocoques s'accompagne d'une inflammation de l'endothélium adjacent et précède la bactériémie. Ce modèle expérimental a été exploité pour évaluer le rôle de facteurs de virulence majeurs du méningocoque. Un mutant dépourvu de capsule est rapidement éliminé des poumons, alors qu'un mutant crgA est invasif. D'autres expériences montrent qu'un mutant isogénique penI (porteur d'altérations de penA), dérivé de la souche sauvage penS, perd de sa virulence. Ceci suggère que les altérations structurales du peptidoglycane, associées aux modifications de la PBP2, peuvent aboutir à une virulence atténuée des souches de sensibilité diminuée à la pénicilline. Ce modèle d'infection méningococcique chez la souris reproduit les principales étapes de la méningococcémie humaine et peut servir à analyser les fonctions de gènes connus ou récemment identifiés d'après les études génomiques.

1.3. Détection intracellulaire du peptidoglycane de N. meningitidis par Nod1. Des muropeptides porteurs d'une chaîne GlcNac-MurNac-tripeptide du peptidoglycane des bactéries Gram-négatives, incluant Nm, sont détectés par la molécule intracellulaire Nod1 qui active la transcription de molécules impliquées dans l'immunité innée via NFkB dans les cellules épithéliales. Ce muropeptide particulier peut constituer un nouveau "pathogen-associated recognition pattern" (PAMP) et une nouvelle cible thérapeutique;

2. Surveillance des infections meningococciques par le Centre National de Référence (CNRM). Les infections méningococciques surviennent sous la forme de cas sporadiques avec une incidence annuelle inférieure à 1 pour 100000 habitants en France. Le CNRM reçoit en moyenne 1000 souches de Nm par an, pour confirmation et typages. Approximativement la moitié des souches correspond à des infections invasives. Les souches de sérogroupe B sont majoritaires (>50%) avec une incidence relativement stable à 270± 28 cas par an. Une augmentation d'incidence du sérogroupe C, a été observée depuis 2001. Cependant, un pic d'incidence du sérogroupe C était déjà apparu en 1992 avec 191 cas (40.2%), suivi d'une décroissance jusqu'en 1995 avec 56 cas (15%) puis une incidence croissante atteignant 235 cas (38.2%) en 2002, et de nouveau une décroissance à 180 cas (31%) est observée en 2003.L'incidence du sérogroupe W135, détecté pour la première fois en 1994, atteignait 9.8% in 2002, mais elle a décru à 5,9% en 2003. Le sérogroupe Y connaît une incidence à 2-3% des infections invasives, mais surtout chez des patients immunocompromis ou âgés. La létalité est de 8 à 10% et est associée aux formes septiques avec purpura fulminans.

3. Epidémiologie moléculaire des infections à N. meningitidis. L'identification et la caractérisation de N. meningitidis dans les échantillons pathologiques sans culture préalable peuvent être réalisées par amplification du gène crgA, suivie par celle de siaD, codant la biosynthèse de la capsule des sérogroupes B, C, Y et W135 ou mynB codant la capsule du sérogroupe A. Cette technique de diagnostic moléculaire est désormais retenue comme un des critères de déclaration obligatoire d'une infection méningococcique invasive (circulaire DGS/SD5C/2002/400). Le typage moléculaire de Nm est essentiel pour déterminer un lien épidémiologique entre les cas. Des loci chromosomiques polymorphes, pilA, pilD, regF, iga et crgA sont amplifiés par PCR puis analysés par "multilocus DNA fingerprinting", qui corrèle avec les données de la "multilocus enzyme electrophoresis", et est complété par "multilocus sequence typing" et électrophorèse en champs pulsé.

4. La surveillance du clone épidémique W135 (ET-37) dans la "ceinture africaine de la méningite". Nous avons été sollicités dès avril 2001 par l'Organisation Ouest-Africaine de la Santé pour enquêter sur les méningites épidémiques au Burkina Faso et au Niger, après que la vaccination entreprise avec le vaccin A&C semblait inefficace. Quatre-vingt dix-huit prélèvements de patients de 16 districts situés entre Bobo Dioulasso et Niamey ont été analysés par PCR pour rechercher l'ADN de Nm, ou de Streptococcus pneumoniae ou Haemophilus influenzae. Soixante-cinq pour cent étaient positifs pour Nm, 7%for S. pneumoniae et 2% pour H. influenzae de type B. La moitié des isolats positifs pour Nm étaient du sérogroupe W135 et l'autre moitié du sérogroupe A. La caractérisation de 12 souches A:4:P1-9 confirmait l'implication du sérogroupe W135 du complexe clonal ET-37 pour la première fois dans des conditions épidémiques en Afrique. L'émergence du sérogroupe W135 (ET-37) en tant que clone épidémique, échappant à la vaccination A&C, en Afrique fut confirmée par une nouvelle épidémie au Burkina Faso en 2002 où plus de 84% des isolats étaient du sérogroupe W135. Cette étude démontrait l'utilité du diagnostic moléculaire pour la surveillance des méningites en conditions épidémiques, pour un choix des valences vaccinales appropriées. Une surveillance biologique des méningites durant les périodes inter-épidémiques ainsi qu'un suivi longitudinal ont été instaurés grâce à un projet collaboratif initié par notre unité, "le projet méningite au Sahel", au Burkina Faso au Centre Muraz de Bobo Dioulasso et au Niger au CERMES de Niamey.

5. Le polymorphisme du gène penA et ses relations avec la sensibilité diminuée des souches à la pénicilline. L'incidence des souches de Nm de sensibilité diminuée à la pénicilline G atteint approximativement 30%. Nous avons étudié le polymorphisme du gène penA, codant la protéine de liaison 2 (PBP2), parmi une collection d'isolats cliniques, incluant des souches sensibles (CMI<0.125mg/L) et des souches de sensibilité diminuée (1 mg/L>CMI?0.125mg/L). Les souches pour lesquelles la CMI de la pénicilline est <0.125mg/L (penS) portent des allèles de penA identiques ou très proches, alors que les souches pour lesquelles la CMI est >0.125mg/L (penI) portent des séquences of penA remaniées. La transformation de penS en penI est obtenue in vitro ou par co-culture des deux génotypes, suggérant une corrélation directe entre les altérations de penA et l'expression d'une sensibilité diminuée à la pénicilline. En comparant l'affinité des PBP2 de souches penS ou penI, nous avons observé que la PBP2 de penI a une affinité moindre que celle de penS, ce qui suggère des changements de conformation de la PBP2 des souches penI, à proximité du site catalytique de PBP2.

5.1. Analyse de la structure du peptidoglycane de N. meningitidis et de ses modifications dans les souches penI. Du fait du rôle des PBPs dans la synthèse du peptidoglycane, nous avons analysé sa structure en spectrométrie de masse et chromatographie et caractérisé 28 muropeptides différents. Des souches penI, ainsi que des mutants de penA d'une souche penS, portent un peptidoglycane de structure altérée avec une augmentation en muropeptides portant le pentapeptide GlcNac et MurNac. Ces changements structuraux du peptidoglycane sont directement liés aux changements de structure de la PBP2 dans les souches penI, suggérant que les souches de sensibilité diminuée à la pénicilline G subissent d'importantes altérations de paroi. De plus, ces altérations semblent affecter la virulence de ces souches (comme exposé ci-dessus 1.2).

Mots-clés: Neisseria meningitidis, Pathogénie moléculaire, Physiopathologie, Epidémiologie, Laboratoire de Référence


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