Unité: Mycologie Moléculaire

Responsable: DROMER Françoise

Une meilleure connaissance de l'interaction entre l'hôte et les champignons pathogènes pourrait améliorer le pronostic des mycoses systémiques. Nous centrons nos recherches sur la pathogénicité de Cryptococcus neoformans et de Candida albicans par une approche simultanée de l'hôte (études cliniques et épidémiologiques, modèles animaux) et du pathogène (facteurs de virulence, variabilité).

Cryptococcus neoformans

L'étude de la physiopathologie des cryptococcoses et des mécanismes de virulence de Cryptococcus neoformans représente à terme les meilleurs moyens d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cryptococcose, en nombre important puisque cette infection opportuniste touche au moins 25% des patients infectés par le virus de l'immunodéficience humaine en zone tropicale. C. neoformans est une levure basidiomycète capsulée qui provoque des méningo-encéphalites de pronostic sévère malgré les traitements antifongiques, ce qui justifie la recherche de mesures thérapeutiques ou prophylactiques nouvelles.

Capsule de C. neoformans (G. Janbon, F. Moyrand, O. Prigneau)

Chaque cellule de C. neoformans est entourée d'une capsule polysaccharidique qui représente le facteur de virulence principal. Ainsi, les souches acapsulées sont avirulentes et la capsule a un effet délétère sur la réponse immunitaire. L'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques nous a permis d'observer une grande variabilité de structure d'une cellule à l'autre au sein d'une même population cellulaire. Notre hypothèse de travail est que la variabilité de la structure de la capsule est, au moins pour une part, responsable de la virulence de C. neoformans. Alors que les mécanismes et les déterminants génétiques de la variabilité antigénique sont connus pour de nombreux micro-organismes procaryotes et eucaryotes, aucune étude n'a été menée en ce sens chez les champignons pathogènes. Nous avons cloné des gènes codant pour divers éléments de la voie de biosynthèse du polysaccharide capsulaire et étudions les mécanismes qui sont responsables de la variabilité de sa structure. Un programme de disruption systématique des gènes potentiellement impliqués dans la synthèse des polysaccharides capsulaires est en cours et devrait aboutir, en deux ans, à la construction de 150 souches mutantes. Ces souches seront notamment utilisées pour identifier les épitopes capsulaires nécessaires au franchissement de la barrière hémato-encéphalique.

Etude d'une protéine de C. neoformans impliquée dans la réponse humorale au cours de la cryptococose (F. Dromer, J. Lemay)

En analysant la réponse humorale chez les souris inoculées par C. neoformans, nous avons mis en évidence l'existence d'anticorps préférentiellement produits par les animaux qui survivaient à l'infection. En collaboration avec JL Guesdon et Sylvie Rouyre (Ingéniérie des Anticorps, nous avons mis au point deux tests immuno-enzymatiques (ELISA et immuno-empreinte) et avons observé qu'une production d'anticorps anti-Pep1p n'était observée, au moment du diagnostic, que chez certains des patients pour lesquels l'évolution de la cryptococcose était favorable. Par ailleurs, plusieurs anticorps monoclonaux spécifiques de divers épitopes de cette protéine ont été générés dont l'un prolongeait la survie des animaux dans le modèle expérimental de cryptococcose disséminée. Des études complémentaires sont en cours pour mieux caractériser le caractère protecteur de ces anticorps.

Etude du franchissement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par C. neoformans (C. Charlier, F. Dromer)

Les mécanismes de franchissement de la BHE par C. neoformans sont encore inconnus. La cinétique de franchissement de la BHE et de la dissémination du pathogène est étudiée dans le modèle de cryptococcose disséminée de la souris non congénique grâce à des techniques classiques d'évaluation de la charge fongique, d'histologie et d'immunohistochimie en collaboration avec Fabrice Chrétien (INSERM EMI 0011, Hôpital H. Mondor, Créteil). Les résultats préliminaires démontrent que le franchissement de la BHE se fait précocément dans les 24 heures suivant l'inoculation intraveineuse. D'autres techniques sont actuellement mises en œuvre pour mieux comprendre ces mécanismes.

Cryptococcoses humaines (F. Dromer, O. Lortholary, O. Ronin).

Nous avons analysé, en collaboration avec A. Fontanet (Epidémiologie des Maladies Emergentes) et Simone Mathoulin-Pélissier (Institut Bergonié, Bordeaux) les modifications épidémiologiques sur la cryptococcose consécutives à l'introduction des traitements antirétroviraux hautement actifs en 1996. En analysant les 1644 cas de cryptococcose répertoriés au Centre National de Référence depuis 1985 chez des sujets séropositifs pour le VIH, nous avons pu démontrer que l'incidence de la cryptococcose avait diminué de 46% depuis 1997, et qu'être originaire du continent africain, avoir plus de 45 ans, avoir été contaminé par le VIH par voie hétérosexuelle, n'avoir eu aucune autre maladie définissant le stade SIDA et ne pas se savoir séropositifs étaient actuellement des facteurs de risques indépendants de cryptococcose. L'absence de prise en charge thérapeutique ou le fait de ne pas se considérer à risque d'infection par le VIH sont des facteurs déterminants dans l'épidémiologie actuelle de la cryptococcose en France.

Une étude observationnelle des conditions d'arrêt de la prophylaxie secondaire de la cryptococcose chez 280 sujets infectés par le VIH et traités par une thérapeutique antirétrovirale hautement active a été mise en place en juin 2001 (responsable O. Lortholary, collaboration INSERM U593 Bordeaux). Nous avons pu montrer que la mortalité initiale de la cryptococcose au cours de l'infection par le VIH restait de 17%, mais que la mortalité globale était significativement diminuée depuis l'introduction des ARV hautement actifs. Chez les patients ayant une restauration immunitaire stable après plusieurs mois de traitement antifongique adapté, l'arrêt de la prophylaxie secondaire antifongique peut désormais être proposé.

Candida albicans

Candida albicans, une levure ascomycète saprophyte du tube digestif, est le deuxième microorganisme étudié dans l'Unité de Mycologie Moléculaire. Cette levure est responsable d'infections sévères chez des patients immunodéprimés par des chimiothérapies aplasiantes, des transplantations d'organes ou de moelle osseuse, mais aussi d'infections nosocomiales dans des services de réanimation.

Etude de la formation de biofilms chez C. albicans et C. glabrata (G. Janbon, F. Dromer, I. Iraqui)

Les biofilms sont des structures tri-dimensionnelles de microorganismes qui se développent sur différents supports. En ce qui concerne les Candida, ces structures peuvent se développer sur les cathéters ou encore sur des prothèses et sont certainement des sources de réinfection après un traitement antifongique. L'objectif de ce projet est donc de déterminer les mécanismes moléculaires de la formation de biofilms à Candida. Ce projet fait l'objet d'un PTR avec les groupes de C. D'enfert (UP Biologie et Pathogénicité fongiques) et de JM Ghigo (G5, Génétique des Biofilms) (PTR50). Nous avons isolé des mutants de C. glabrata ne formant plus de biolfilms et d'autre en formant davantage que la souche sauvage. L'etude de ces mutants nous a permis d'identifier une adhésine essentielle pour la formation de biofilm par C. glabrata et de comprendre les mécanismes de régulation de la transcription du gène qui la code. Par ailleurs, nous avons délété deux gènes codant pour les β-glucosidases de paroi de C. albicans dont l'expression est induite lors de la formation des biofilms et identifiés grâce à l'étude du transcriptome. L'étude de ces mutants nous a permis de confirmer le rôle essentiel de ces protéines dans la formation de biofilm par C. albicans.

Centre National de Référence Mycologie et Antifongiques (F. Dromer, O. Lortholary).

Les nouvelles missions du CNRMA sont très variées. Elles impliquent d'une part, une expertise dans le domaine de l'identification des levures et des champignons filamenteux pathogènes (D. Hoinard, J.-C. Gantier, D. Garcia-Hermoso, O. Ronin), leur typage moléculaire (S. Bretagne, D. Garcia-Hermoso), et les tests de sensibilité aux antifongiques (D. Hoinard, D. Garcia-Hermoso, O. Ronin), ainsi que dans la prise en charge des patients suspects ou atteints de mycoses sévères par le biais de conseils, et d'autre part, la surveillance épidémiologique des mycoses sévères, rares ou exotiques, et de la résistance aux antifongiques. Une surveillance active (l'Observatoire des Levures) a été mise en place pour surveiller ces infections en région parisienne et caractériser, au cours du temps, les espèces de levures responsables de fongémies (identification, typage, profil de sensibilité).

Etude de l'efficacité des associations d'antifongiques in vitro et in vivo (E. Dannaoui, P. Schwarz, F. Dromer, O. Lortholary)

Plusieurs approches ont été utilisées pour tester in vitro l'activité d'associations doubles ou triples d'antifongiques sur Aspergillus fumigatus et C. neoformans. Les antifongiques testés étaient l'amphotéricine B, la 5-fluorocytosine, la caspofungine, et des azolés (fluconazole, itraconazole ou voriconzole). La technique de l'échiquier, micro-méthode en milieu liquide dérivée de la technique du comité de standardisation américain (NCCLS) pour la détermination de la concentration minimale inhibitrice d'un seul antifongique, a permis l'évaluation d'associations doubles d'antifongiques et a été adaptée, pour la première fois à notre connaissance, pour l'étude d'associations triples. Des techniques de diffusion en milieu gélosé ont également été utilisées pour tester la sensibilité d'A. fumigatus à des associations doubles, ainsi que des courbes de fongicidie pour explorer de façon dynamique l'activité antifongique des associations sur C. neoformans. Ces études ont permis de démontrer l'intérêt potentiel d'associations d'antifongiques encore inexploitées et se poursuivent actuellement par l'étude de l'efficacité de ces associations in vivo dans les modèles animaux d'aspergillose et de cryptococcose disséminées.

Mots-clés: Cryptococcus neoformans, capsule, polysaccharide, mycologie, physiopathologie, antifongiques, Candida albicans, Candida glabrata, Aspergillus sp., biofilms, barrière hémato-encéphalique


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