Unité: Signalisation Imunoparasitaire

Responsable: Gordon Langsley

Les leucocytes infectés par Theileria présentent les caractères propres des cellules tumorales et cela indépendamment du type cellulaire. Ils se multiplient en culture avec un index mitogénique élevé de façon indéfinie et cela, sans ajout de facteurs de croissance. Outre cette capacité de croissance illimitée, les cellules infectées acquièrent un phénotype transformé. En effet, leur injection à des souris immunodéficientes (souris SCID) provoque la formation de tumeurs. Un point important dans ce modèle d'immortalisation leucocytaire est la réversibilité de ce phénomène. En effet, le traitement des cellules infectées avec une drogue Theilericide spécifique arrête la prolifération et les lymphocytes hôtes redeviennent des cellules quiescentes. Les cellules infectées par Theileria représentent donc un modèle unique pour l'étude des mécanismes du contrôle d'activation et de transformation lymphocytaire.

       L'activité transactivatrice AP-1 constitutive chez les lymphocytes B transformés par T. parva résulte de l'expression accrue, telle qu'évaluée par immunoblot à l'aide d'anticorps spécifiques, de tous les membres de la famille Jun, alors que parmi les protéines Fos, c-Fos est majoritairement induite. L'induction des protéines Jun et Fos, et donc l'activité AP-1 dans les cellules infectées, dépend de la présence du parasite car est abolie dans les cellules traitées avec le BW720c. Nous avons caractérisé les voies d'activation d'AP-1 et établi le rôle essentiel des MAP kinases du groupe JNK (c-Jun N terminal kinases). Aucune activité kinase p38 n'est détectée et l'état d'activation des MAPK du groupe ERK qui phosphorylent ELK-1, a également été déterminé : les kinases ERK ne sont pas non plus activées dans les leucocytes transformés par Theileria. Bien que l'état de phosphorylation d'ELK-1 n'a pas été examiné, la sur-expression transitoire d'une protéine phosphatase, CL100, spécifique des MAPK (JNK, ERK et p38), inhibe l'activité d'un gène rapporteur luciférase placé sous le contrôle du promoteur de c-fos et également un rapporteur contenant des sites AP-1 consensus, établissant un rôle essentiel des JNK dans l'induction d'AP-1.         Pour étudier le rôle d'AP-1 dans l'immortalisation et la transformation des lymphocytes, nous avons crée des lignées stables exprimant de façon conditionnelle un mutant de c-Jun humain délété de son domaine de transactivation. Nous avons choisi le système inductive par la tétracycline décrit par Gossen et Bujard et établi deux clones, l'un exprimant le transactivateur tTA réprimé en présence de tétracycline (clone t1.4), l'autre, la transactivateur rtTA, activé par l'ajout de tétracycline (clone r6.12). L'ADN codant pour le mutant de c-Jun marqué avec l'épitope Flag (Flag c-Jun D169) a été sous-cloné dans un vecteur sous le contrôle du promoteur inductible/répressible par la tétracycline et possédant une cassette de résistance à l'histidinol.

        L'injection sous-cutanée de lymphoblastes parasités (dans lesquels nous avons également introduit la GFP) à des souris SCID entraîne la formation de masses tumorales qui injectées par voie intrapéritonéale infiltrent le foie, les reins, les poumons. L'injection des lymphocytes qui expriment la c-Jun D169 ne donne pas des tumeurs en accord avec un rôle d'AP-1 dans la métastase Theileria-dépendante.

In vivo les ser/thr protéine phosphatases PP1 et PP2A forment une famille de plusieurs holoenzymes d'expression ubiquiste qui sont produites par l'interaction spécifique entre des sous-unités catalytiques (PP1c et PP2Ac) et une grande variété de sous-unités régulatrices qui sont impliquées dans le ciblage et/ou la régulation de l'activité phosphatasique. Nos travaux récents suggèrent que les sérine/thréonine protéines phosphatases de type 1 (PP1) et de type 2A (PP2A) représentent des nouvelles cibles potentiellement importantes pour le contrôle de l'apoptose, notamment dans les cellules cancéreuses, ainsi que pour le contrôle des infections virales ou parasitaires. Nos récents suggèrent plus particulièrement un rôle crucial de PP1/PP2A dans la régulation des protéines Bcl-2 et de la survie des cellules. 

Grâce à des techniques de microscopie confocale et de compartimentation biochimique nous avons trouvé que Bad, un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2, est séquestré sous forme non phosphorylé par les rafts ce qui l'empêche d'exercer sa fonction pro-apoptotique au niveau de la mitrochondrie ; de façon consistante la désorganisation des rafts par la methyl-b cyclodextrine induit l'apoptose. Ces résultats nous ont permis de proposer que la séquestration de Bad par les rafts sous sa forme active (déphosphorylée) pourrait correspondre à un nouveau mécanisme d'ordre général. Nous étudierons ce mécanisme qui d'après nos premières approches en cours pourrait impliquer la myristoylation et la phosphorylation de Bad. En particulier nous analyserons le rôle de PP1/PP2A dans la régulation des phénomènes de phosphorylation de Bad et dans la dérégulation de la survie cellulaire résultant de la transformation blastique physiologiquement induite par le parasite Theileria.

       Une nouvelle approche thérapeutique : le "KO " peptidique du signal PP1/PP2A a pour but l'inhibition de processus pathologiques par transfert intracellulaire de peptides mimant des sites d'interaction avec les protéines phosphatases PP1/PP2A. L'interaction de certaines molécules d'origine cellulaire ou codées par un agent pathogène de type viral ou parasitaire avec des protéine phosphatases de type PP1 ou PP2A induit des signaux qui pourraient être impliqués dans diverses pathologies. Cette analyse nous conduit à proposer une approche générale basée sur l'identification et sur la délivrance intracallulaire de peptides mimant des sites d'interaction de différentes protéines d'intérêt avec les protéines de la famille phosphatases PP1 et PP2A. En conclusion, ce projet, qui implique deux champs ; apoptose et phosphatase, a pour but principal d'étudier la survie des cellules transformées par les parasites Theileria. Nous proposons aussi de développer une nouvelle approche générale à caractère thérapeutique basée sur la délivrance intracellulaire de peptides mimant les sites d'interaction de protéines d'intérêt avec les phosphatases PP1/PP2A.

Mots-clés: parasite, Theileria, signalling, transformation, apoptosis, metastasis


Activity Reports 2003 - Institut Pasteur
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