Unité: Génétique Moléculaire Bactérienne

Responsable: COLE Stewart

Afin de poursuivre notre avancée dans la connaissance de la tuberculose et de la lèpre, une approche de génomique comparative et fonctionnelle a été entreprise sur leurs agents étiologiques respectifs, Mycobacterium tuberculosis et M. leprae. De nouvelles cibles pour la mise au point de médicaments et de nouveaux candidats vaccins sous-unitaires ont été identifiés et sont actuellement en cours de caractérisation.

Cette approche a été étendue à un pathogène émergent à l'origine de l'ulcère de Buruli, M. ulcerans.

Le pouvoir pathogène de Clostridium difficile et de C. perfringens est causé par de puissantes toxines, et on a découvert qu'un nouveau facteur sigma est nécessaire à la transcription des gènes des toxines majeures de C. difficile.

Génomique fonctionnelle des mycobactéries (Stewart Cole, Roland Brosch, Priscille Brodin, Caroline Demangel, Brigitte Saint-Joanis)

Mycobacterium tuberculosis, l'agent de la tuberculose humaine, partage plus de 99,9 % d'identité de son ADN avec les autres membres du complexe du bacille tuberculeux : M. bovis, l'agent de la tuberculose bovine, M. bovis BCG, la souche vaccinale dérivée de M. bovis, M. africanum, un pathogène de l'homme d'origine africaine, M. canetti, un bacille tuberculeux atypique chez l'homme, et M. microti, responsable de la tuberculose chez certains rongeurs. Comme le BCG (bacille de Calmette et Guérin), la plupart des souches de M. microti sont inoffensives pour l'homme. Des études de génomique comparative ont montré que plusieurs régions de différence (RD1-RD14), codant pour environ 140 protéines, sont absentes chez M. bovis BCG, la souche vaccinale, contrairement à la souche virulente M. tuberculosis H37Rv. Une étude de la présence ou de l'absence de ces régions chez un plus grand nombre de souches du complexe M. tuberculosis a permis de définir des relations phylogénétiques entre les différents membres du complexe et de proposer un nouveau schéma de l'évolution des bacilles tuberculeux, remettant en question l'hypothèse actuelle selon laquelle M. bovis serait l'ancêtre de M. tuberculosis. Cette étude a également démontré que certaines de ces régions de différence (TbD1, RD9) sont des marqueurs puissants pour l'identification rapide des bacilles tuberculeux.

Dans une perspective vaccinale, la région RD1 est particulièrement intéressante car elle est la seule région absente des souches vaccinales M. bovis BCG et M. microti, et présente chez tous les autres membres du complexe. De plus, RD1 code pour deux antigènes immunodominants de la famille d'ESAT-6. Nous avons montré que la complémentation du BCG par RD1 (BCG::RD1) s'accompagne d'un changement de morphologie des colonies, qui les rapproche des souches virulentes. Chez les souris immunodéficientes, BCG::RD1 se dissémine significativement plus que le BCG. Toutefois, BCG::RD1 reste beaucoup moins virulent que M. tuberculosis, et sa persistance est bien contrôlée par les organismes hôtes immunocompétents. Cette démarche a révélé également l'existence d'un appareil nécessaire à la sécrétion d'ESAT-6 et à l'induction de réponses immunitaires cellulaires spécifiques de type Th1. L'immunogénicité de BCG::RD1 a été améliorée et le niveau de protection contre la tuberculose extrapulmonaire et sa pathologie ont été augmentées de façon significative par rapport à l'immunisation par le BCG seul. Des résultats similaires ont été obtenus suite à l'immunisation par M. microti::RD1 dont la virulence et la persistance sont moins importantes que le BCG::RD1. La mise au point de BCG::RD1 et M. microti::RD1 représente donc une avancée importante dans la définition de vaccins anti-tuberculeux plus efficaces, dont nous poursuivons actuellement l'optimisation.

Analyse post-génomique de Mycobacterium leprae (Nadine Honoré, Marc Monot, Romulo Araoz)

En 2003, nous avons exploré la biodiversité chez M. leprae à l'aide des biopuces et des séquences répétées afin de mettre en évidence des marqueurs génétiques polymorphes susceptibles de servir d'outils épidémiologiques. Cette étude a montré d'une part une grande stabilité au sein du génome et d'autre part une plasticité importante associée aux répétitions en tandem.

Le contrôle de la lèpre ne sera possible que par une identification rapide de tous les cas infectieux; c'est pourquoi la mise au point de tests de détection sensibles et fiables est primordiale. La génomique comparative et l'analyse informatique ont permis de produire et purifier une dizaine de protéines, et des études préliminaires ont montré que certaines d'entre elles hébergent des épitopes reconnus par les lymphocytes de malades, ce qui est de bon augure pour le développement d'un test immunodiagnostic.

Le séquençage du génome de Mycobacterium bovis et de M. bovis BCG Pasteur (Thierry Garnier, Stewart Cole)

La finition de la séquence ainsi que son annotation ont été réalisées. Brièvement, le génome de M. bovis comprend 4345492 paires de bases et code pour 3952 gènes. L'obtention de cette séquence nous a permis des comparaisons tant au niveau nucléotidique (" Single Nucleotide Polymorphism ") qu'au niveau génétique avec le génome de M. tuberculosis.

Cette approche ouvre des perspectives pour identifier les gènes responsables de la spécificité d'hôte - M. bovis infectant principalement les animaux et M. tuberculosis étant l'agent infectieux chez l'homme -, étudier les variations antigéniques et expliquer les différences observées dans les voies métaboliques. Actuellement nous terminons le séquençage et l'analyse par bioinformatique du génome de la souche vaccinale M. bovis BCG Pasteur. La comparaison de cette séquence génomique avec celles de M. bovis et de M. tuberculosis nous permettra de mieux comprendre les bases de l'atténuation du BCG.

Analyse génomique de Mycobacterium ulcerans (Tim Stinear, Peter Leadlay)

Mycobacterium ulcerans, pathogène émergent à l'origine de l'ulcère de Buruli responsable de lésions de la peau chroniques et nécrosantes, s'est rapidement révélé être une cause importante de morbidité à travers le monde. Sa prévalence en Afrique de l'Ouest semble avoir considérablement augmenté depuis les années 1980. L'ulcère de Buruli est considéré comme la troisième maladie mycobactérienne la plus répandue chez les sujets immunocompétents, après la tuberculose et la lèpre. Contrairement aux autres pathogènes mycobactériens, M. ulcerans semble demeurer extracellulaire pendant la durée de l'infection et produit une toxine macrolide, la mycolactone. On a actuellement recours à l'approche génomique afin de comprendre l'épidémiologie, la biologie et la pathogenèse de cette importante maladie émergente, et de trouver de nouveaux moyens prophylactiques et thérapeutiques.

Le projet de séquençage du génome de M. ulcerans entre en phase de finition mais a déjà fourni beaucoup d'informations concernant le mécanisme de production de mycolactone, la toxine macrolidique responsable de la pathologie associée à l'ulcère de Buruli. Nous avons découvert que le génome de M. ulcerans est constitué d'un chromosome et d'un plasmide circulaire de 174 kb, pMUM001, qui porte un cluster de gènes qui codent pour des enzymes géantes, les polykétides synthases (PKS), dont le rôle biologique est la production de mycolactone. Nous avons donc montré pour la première fois chez les mycobactéries qu'un plasmide contribue au pouvoir pathogène, et ceci nous amène à supposer que l'émergence de M. ulcerans en tant que pathogène humain est sans doute le résultat de l'acquisition récente de pMUM001 par transfert horizontal.

Etude du pouvoir pathogène des Clostridies (Gilles Reysset, Bruno Dupuy)

Les recherches que nous menons sur le pouvoir pathogène de Clostridies toxinogènes (Clostridium perfringens et Clostridium difficile), concernent l'étude des mécanismes de régulation des principales exotoxines, et l'identification et la caractérisation de nouveaux facteurs de virulence pouvant êtres impliqués dans la pathogénie de ces deux bactéries.

L'adaptation aux stress oxydatifs de C. perfringens, agent responsable de maladies pouvant aller de la simple intoxication alimentaire à l'entérite nécrotique ou la gangrène gazeuse, constitue vraisemblablement un facteur de pathogénicité important pour cette bactérie ubiquitaire. En effet, la capacité de résister aux stress oxydatifs permettrait en particulier à C. perfringens, de survivre dans les phagosomes des macrophages et d'éviter ainsi les défenses immunitaires de l'hôte. L'analyse de la séquence du génome de la souche 13 de C. perfringens a montré que cette bactérie possède des gènes codant pour une superoxyde dismutase (sod), deux superoxydes réductases (sor), trois gènes susceptibles de coder pour des rubrédoxines pouvant jouer le rôle de peroxydase, ainsi qu'un gène codant pour une alkhyl-peroxydase (ahp). Par des études de complémentation fonctionnelle de souches d'E. coli dépourvue d'activité superoxyde dismutase, de catalase ou d'alkyl-peroxydase, par les gènes homologues de C. perfringens, nous avons pu déterminer leur fonction enzymatique. De plus, l'étude de l'expression transcriptionnelle de ces gènes nous a permis de préciser leur rôle respectif dans la réponse adaptative de C. perfringens aux différents stress oxydatifs.

Parmi les cibles potentielles qui permettraient l'élaboration d'inhibiteurs capables de contrôler l'initiation et/ou l'établissement du cycle infectieux, de C. perfringens, nous travaillons sur la fonction et le pouvoir antigénique de quatre protéines CBP, (Choline Binding Protein), affines aux résidus cholines. Les protéines CBP sont présentes quelque soit le toxinotype des souches de C. perfringens et se trouvent majoritairement dans la membrane cellulaire.

Le pouvoir pathogène de C. difficile, responsable de colites pseudomembraneuses (CPM) et de la majorité des diarrhées post-antibiothérapiques (AAD), repose essentiellement sur la capacité de cette bactérie à produire en quantités suffisantes deux toxines majeures, ToxA et ToxB. La transcription des gènes tox est sous le contrôle d'un facteur sigma alternatif, le produit du gène txeR, qui régule sa propre expression et celle des toxines A et B au cours du temps et en réponse aux changements de l'environnement (sources carbonées, température, biotine et certains acides aminés). Nous avons montré que l'expression de la bactériocine de la souche CPN50 de C. perfringens est aussi sous le contrôle d'un facteur sigma, le produit du gène uviA, homologue de TxeR et que l'activité de ces deux facteurs sigma est interchangeable in vivo comme in vitro. TxeR et UviA ont été récemment classés dans un nouveau sous groupe de la famille des σ 70 d'E. coli (classe V) sur la base de leur interactivité et de la faible homologie de séquences qu'ils présentent avec les autres facteurs sigma connus à ce jour.

Mots-clés: Génomique fonctionnelle , complexe Mycobacterium tuberculosis , lèpre , ulcère de Buruli , Clostridies


Activity Reports 2003 - Institut Pasteur
filet

Page Top research Institut Pasteur homepage

If you have problems with this Web page, please write to rescom@pasteur.fr