Unité: Immunophysiologie et Parasitisme Intracellulaire

Responsable: MILON Geneviève

Dans notre Unité sont analysés et caractérisés, à l'échelle tissulaire, cellulaire et subcellulaire, des processus qui rendent compte des interactions renouvelées et durables que des parasites eucaryotes, les leishmanies, établissent (a) avec des organismes hôtes (la souris, un hôte expérimental), (b) in vitro avec des leucocytes hôtes (phagocytes professionnels). Ces analyses sont menées dans le contexte de la compréhension (i) des processus asymptomatiques, (ii) des processus pathogènes et (iii) de leur prévention et dans celui, trop négligé, de la transmission des leishmanies de l'hôte mammifère à l'hôte vecteur, un insecte diptère hématophage, le phlébotome.

L'intitulé de notre Unité indique le cadre dans lequel s'inscrivent nos activités de recherche et de partage de savoir et savoir-faire. En effet, les leishmanies, objets de nos études, sont des parasites protozoaires, dont la pérennité dépend de deux autres organismes vivants, le phlébotome femelle adulte, insecte hématophage et un mammifère. Chez l'insecte, le développement des parasites a lieu dans le tube digestif ; au sein de cette niche, les leishmanies sont extracellulaires et sont désignées par le terme "promastigotes" ; au terme d'un cycle de prolifération où elles sont attachées à la membrane apicale des cellules épithéliales, elles se détachent et se différencient en promastigotes métacycliques, les seuls stades de développement qui s'établissent chez l'hôte mammifère. En l'absence d'un insectarium où établir des colonies de phlébotomes, nous analysons et caractérisons, pour le moment, les interactions dynamiques et durables que ces parasites établissent chez des mammifères - souris de laboratoire - voire des sujets humains, hôtes chez lesquels leur style de vie est strictement intracellulaire. Ces études ont été/sont aussi alimentées par des acquis conceptuels et méthodologiques que nous avons fait émerger lors de nos études sur les interactions Listeria monocytogenes/souris de laboratoire et témoignent de notre volonté de caractériser les traits singuliers du parasitisme.

Des leucocytes phagocytaires mononucléés de souris in vitro : des cellules hôtes qu'envahissent les promastigotes métacycliques de Leishmania spp. et au sein desquelles ils se différencient en amastigotes  (E. Fontan ® 31/08/03, T. Lang, M. Lebastard, E. Prina, J.-C. Antoine).

Deux espèces de Leishmania, L. amazonensis et L. major (NIH 173), ont été sélectionnées dans la mesure où l'obtention, in vitro, du stade de développement, promastigotes métacycliques, est relativement aisée. Caractériser les propriétés des vacuoles parasitophores (VP) où (1) se "logent" les promastigotes métacycliques, (2) se différencient et (3) se multiplient les stades amastigotes exige que soient produites, in vitro, des populations homogènes de leucocytes phagocytaires, qu'il s'agisse de leucocytes du lignage phagocytaire mononucléé ou des leucocytes " immatures " des lignages des leucocytes dendritiques, des lignages "versatiles" et réactifs à de nombreux signaux exogènes du système multifocal qu'est le système immunitaire ou du micro-environnement tissulaire dans lequel ils résident (par exemple le tissu cutané, les organes lymphoïdes secondaires). Nous sommes très attentifs à ce que ces "contraintes" soient prises en compte pour tenter de mimer - le plus pertinemment possible - les micro-environnements tissulaires où s'établissent ces parasites intracellulaires. Il a été possible d'établir que les VP, où s'établissent, se différencient, puis se multiplient L. amazonensis sont des compartiments subcellulaires très dynamiques. L'analyse de leur membrane et de leur contenu luminal a permis de révéler l'existence de processus subcellulaires et moléculaires qui impliquent, entre autres, le cytosquelette d'actine " cortical " et des compartiments subcellulaires très dynamiques que sont les endosomes, les lysosomes. En outre, comme nous savons que ces leucocytes hôtes peuvent être des leucocytes (a) qui activent des lymphocytes T naïfs ou (b) qui ré-activent des lymphocytes T différenciés, sont également en cours d'étude les processus subcellulaires et moléculaires qui pourraient rendre compte de la biogénèse ou non des ligands des récepteurs des lymphocytes T CD4, CD8, voire des lymphocytes T CD1-restreints. Pour la partie leucocytes dendritiques, ces études sont menées en collaboration avec Nathalie Winter (Unité de Génétique mycobactérienne).

Le tissu cutané : un micro-environnement où s'établissent les leishmanies et à partir duquel elles sont transmises au vecteur : de la pathogénèse des lésions cutanées plus ou moins transitoires qui se développent au site d'inoculation, aux processus qui sous-tendent, dans des sites cutanés distants, leur transmission au vecteur (J.-C. Antoine, S. Goyard ® 30/06/03, T. Lang, M. Lebastard, L. Nicolas, E. Prina, H. Saklani ® 31/08/03 - collaboration avec E. Perret, P. Roux, S. Shorte (PFID) ; P. Douillard, S. Saeland, Schering Plough, Dardilly, G. Milon).

Pour tenter de caractériser les processus " discrets " via lesquels les leishmanies s'établissent et persistent, in vivo, dans le derme de leurs hôtes mammifères, nous avons tenu compte de propriétés de l'écosystème naturel au sein duquel circulent les leishmanies. Chez leurs hôtes diptères, après une phase d'expansion de la population des promastigotes au contact des cellules épithéliales de l'intestin moyen, il y arrêt des processus de division cellulaire et différenciation en promastigotes métacycliques qui, soit persistent dans un gel au niveau de la lumière de l'intestin moyen, soit atteignent la partie antérieure du tube digestif. Quel que soit le site à partir duquel sont régurgités ces promastigotes métacycliques, le nombre déposé dans le derme superficiel de l'hôte, source de sang, est estimé entre 10 et 1.000/sondage/repas sanguin. Aussi, avons-nous inoculé entre 10 et 10.000 leishmanies métacycliques, soit de L. amazonensis, soit de L. major dans le derme de l'oreille de souris C57Bl/6, B10D2 ou BALB/c. Plusieurs processus sont analysés : outre l'absence, la présence de signes cliniques, leur guérison ou non au site d'inoculation sont estimées les charges parasitaires, d'une part dans le site d'inoculation, mais aussi dans l'organe lymphoïde drainant, dans les tissus qui contrôlent l'homéostasie du sang (foie, rate, moelle osseuse) et des tissus cutanés distants glabres ou non (oreille contralatérale, queue, peau scapulaire…). Il importe de noter que la lésion cutanée transitoire au site d'inoculation de L. major chez C57Bl/6, traduit une séquence d'événements discrets que nous pouvons décrire qualitativement et quantitativement comme suit : au niveau de l'oreille inoculée (a) une phase de différenciation promastigote ® amastigote, (b) une phase d'expansion des amastigotes au sein de leucocytes phagocytaires mononucléés, dont l'origine locale ou non et les propriétés sont en cours d'étude, puis (c) une réduction de la charge parasitaire. Cette phase de réduction de la charge parasitaire est couplée à un recrutement de leucocytes non T non B (monocytes, neutrophiles, éosinophiles, des leucocytes dendritiques). Ce recrutement tardif est initié par l'extravasation, dans le derme, de lymphocytes T CD4 et CD8 réactifs à des peptides parasitaires. Il semble que le recrutement et le renouvellement de ces lymphocytes CD4 et CD8 traduisent un processus d'activation initié dans le ganglion lymphatique drainant dès que des leucocytes abritant des amastigotes cultivables/viables atteignent cet organe lymphoïde secondaire. Des mises au point sont en cours pour caractériser quels sont, parmi les différents lignages leucocytaires potentiellement "détournables" comme des leucocytes navettes (leucocytes dendritiques, polynucléaires neutrophiles, voire éosinophiles…), ceux qui le sont, ce en distinguant deux destinations : (1) le ganglion drainant, (2) les sites cutanés distants. Notons que dans les sites cutanés distants atteints par des leishmanies dont la population reste stable et faible, aucun signe clinique n'est perceptible. Ce processus d'établissement durable d'une population parasitaire - dont l'effectif est stable, dans un site cutané cliniquement muet - est en cours d'analyse : nous avons en effet formulé l'hypothèse que ces amastigotes sont les stades de développement transmissibles au vecteur hématophage. En outre, nous allons établir si ces amastigotes sont en phase Go du cycle cellulaire. Pour ce faire, des leishmanies (L. major, L. amazonensis) transgéniques ont été construites (gènes codant pour des protéines naturellement fluorescentes ou pour la luciférase d'une part, gène "suicide" d'autre part). Sont également étudiées comme hôtes des leishmanies des souris C57Bl/6 dont le gène de la langérine a été inactivé (la langérine est une lectine surtout exprimée par les leucocytes dendritiques que sont les cellules de Langerhans de l'épiderme ou des épithelia pseudostratifiés).

Mots-clés: Leishmania spp., Immunophysiologie, Parasitisme intracellulaire, Programme génétique des différents stades de développement des parasites, Transmission et propriétés invasives des parasites


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