Unité: Intéractions Bactéries- Cellules

Responsable: Cossart Pascale

Notre Unité étudie les bases moléculaires et cellulaires du pouvoir pathogène de Listeria monocytogenes, qui est un système modèle pour l'étude du parasitisme intracellulaire. L. monocytogenes est responsable d'infections alimentaires graves, qui se manifestent par des gastro-entérites, des septicémies, des méningites et des avortements, avec un taux de mortalité de 30 %. Les sujets à risque sont les femmes enceintes et les foetus, les nouveau-nés, les personnes âgées, ainsi que les sujets immunodéprimés. L. monocytogenes est une bactérie intracellulaire qui peut traverser la barrière intestinale, puis les barrières hémato-encéphalique ou fœto-placentaire, envahir de nombreux types cellulaires et s'y multiplier. Les bactéries se déplacent dans le cytosol et passent de cellule en cellule en utilisant un mode de propulsion original: la polymérisation de l'actine cellulaire à l'un des pôles bactériens. En 2003, notre activité a porté sur l'étude des composants bactériens et cellulaires contrôlant l'entrée des bactéries dans les cellules, l'identification de nouveaux gènes de virulence, la régulation de l'expression de ces gènes et sur les mécanismes d'ancrage des protéines de surface. Des travaux d'épidémiologie moléculaire et d'étude de la biodiversité de L. monocytogenes ont aussi été entrepris. Parallèlement, nous avons poursuivi l'étude de la motilité actine-dépendante d'une autre bactérie intracellulaire, Rickettsia conorii, et l'analyse de son mécanisme d'entrée dans les cellules.

Entrée de L. monocytogenes dans les cellules épithéliales:

Rôle des internalines InlA et InlB, deux protéines bactériennes impliquées dans l'entrée

InlA et son récepteur la E-cadhérine (M. Lecuit, S. Sousa).

Nous avons démontré que l'entrée dans les cellules nécessite l'interaction du domaine cytoplasmique de la E-cadhérine avec cytosquelette d'actine via les caténines et l'intervention de la myosine VIIa non conventionnelle. La myosine VIIa est maintenue aux jonctions adhérentes par l'alpha-caténine et la vézatine, une molécule transmembranaire adaptatrice. Comme les caténines, la myosine VIIa et la vézatine sont recrutées au site d'entrée de L. monocytogenes. Les recherches s'orientent vers des molécules régulant la polymérisation de l'actine, telles les GTPases et différents activateurs/nucléateurs, ainsi que vers l'étude des forces motrices générées par les myosines .

La protéine InlB et ses récepteurs gC1q-R et Met (H. Bierne, N. Khelef)

InlB est associée de façon labile à la surface de la bactérie et interagit avec plusieurs récepteurs: gC1q-R, le récepteur de la forme globulaire du composant du complément C1q, Met le récepteur de l'HGF et les glycosaminoglycanes. Met appartient à la famille des récepteurs aux facteurs de croissance à activité tyrosine kinase permettant de transduire les signaux cellulaires requis pour l'entrée dépendante de InlB. gC1q-R n'a pas de domaine transmembranaire, ni de domaine cytoplasmique. Son rôle dans l'invasion cellulaire, notamment comme co-récepteur de Met est en cours d'étude.

La signalisation et les réarrangements du cytosquelette lors de l'entrée InlB-dépendante (H. Bierne, N. Khelef)

L'entrée InlB-dépendante met en jeu des réarrangements du cytosquelette médiés par le complexe Arp 2/3, le couple cofiline-LIM-kinase et Rac, une Rho-GTPase, qui régulent la polymérisation de l'actine. En utilisant des mutants dominant négatifs, nous avons montré que les molécules WAVE et ENA/VASP sont impliquées dans la formation de la coupe d'actine au site d'entrée et poursuivons l'analyse des évènements permettant la polymérisation de l'actine.

InlB active la PI 3-kinase, qui stimule la PLC-gamma, induisant la production d'IP3 et la libération de calcium. InlB stimule aussi NF-KB via Ras et Akt. Les conséquences de l'activation de ces voies de signalisation, notamment dans les mécanismes de survie cellulaire sont en cours d'analyse .

Autres mécanismes impliqués dans l'entrée (S. Dramsi, S. Dupuis, J. Pizarro-Cerda, S. Seveau)

Nous avons établi que la listériolysine qui est importante pour l'échappement des bactéries hors de la vacuole de phagocytose génère un influx de calcium extracelllulaire qui stimule l'entrée dans les cellules épithéliales. Nous avons aussi démontré que le cholestérol membranaire joue un rôle prépondérant dans l'invasion cellulaire par L. monocytogenes, suggérant l'implication de microdomaines lipidiques membranaires dans les étapes régulant l'entrée. Parallèlement, nous avons montré que la PI 4-K est recrutée au site d'entrée de billes recouvertes de InlA ou InlB. Enfin, nous avons découvert que la septine 9, une GTPase capable de former des filaments colocalisant avec l'actine filamenteuse et les microtubules, est recrutée par L. monocytogenes ou des billes recouvertes de InlA ou InlB. Les contributions précises de la PI 4-K et de la septine 9 sont en cours d'évaluation à l'aide de mutants dominant négatifs et de la technique d'inactivation génique par RNA interférence.

II. Identification de nouveaux mécanismes de virulence de L. monocytogenes

Identification de nouveaux gènes de virulence par mutagenèse aléatoire (D. Cabanes, J. Johansson, P. Mandin)

Nous avons identifié par mutagenèse aléatoire de nouveaux gènes de L. monocytogenes importants pour le processus infectieux dans le modèle murin. Ils codent la protéine FbpA et un système à deux composants, VirR/VirS. FbpA est une protéine de surface sans séquence signal, suggérant un mécanisme nouveau d'adressage de protéines à la surface bactérienne. FbpA lie la fibronectine et permet l'adhésion des bactéries aux cellules. L'expression de FbpA est importante pour celle de deux autres facteurs de virulence, la listeriolysine et InlB, suggérant que FbpA pourrait aussi jouer un rôle de chaperonne. L'analyse transcriptomique du système VirR/VirS a montré qu'il régule un grand nombre de gènes, dont certains impliqués dans la virulence. Ces gènes, leur mécanisme de régulation et les signaux contrôlant l'expression du régulon VirR/VirS sont en cours d'étude.

Approche post-génomique de l'étude de la virulence de L. monocytogenes (C. Archambaud, H. Bierne, D. Cabanes, O. Dussurget, C. Sabet)

L'exploitation des séquences complètes des génomes de L. monocytogenes et de l'espèce non pathogène Listeria innocua, nous a permis d'identifier de nouveaux gènes de virulence par mutagenèse ciblée. Nous avons inactivé des gènes présents chez L. monocytogenes et absents chez L. innocua, codant pour des facteurs impliqués dans l'infection:

- une hydrolase des sels biliaires (Bsh) dont l'expression est régulée par PrfA, qui favorise la résistance des bactéries à la bile et leur persistance dans la lumière intestinale. Le gène codant la Bsh est absent des souches de L. innocua et se révèle un nouvel outil d'identification des Listeria.

- plusieurs protéines de surface impliquées dans l'entrée dans les cellules et dans la virulence dans différents modèles animaux, dont une nouvelle autolysine (Auto).

- une sérine/thréonine phosphatase dont nous étudions le rôle dans la virulence, l'activité sur d'autres facteurs et les cibles bactériennes et cellulaires éventuelles.

- deux sortases qui ancrent des protéines de surface par l'intermédiaire du motif LPXTG pour la sortase A et d'un motif nouvellement identifié (NXXTX) pour la sortase B. La délétion du gène codant pour la sortase A abolit l'ancrage de plusieurs protéines de surface de la famille LPXTG et atténue la virulence au cours des étapes précoces de l'infection. La délétion du gène codant pour la sortase B est sans effet sur la virulence. La contribution précise de la sortase B et la recherche de ses cibles sont en cours d'étude.

Des études de la biodiversité de Listeria ont été réalisées en utilisant la génomique comparative entre deux souches de sérovars différents de L. monocytogenes (4b et 1/2a) et l'analyse génomique de 113 autres souches (Collaboration avec M. Doumith et P. Martin, Centre de Référence des Listeria, et C. Buchrieser, Laboratoire des Microorganismes Pathogènes, Institut Pasteur). Trente marqueurs spécifiques de L. monocytogenes et de différents sérovars ont été identifiés, ouvrant la voie au développement de nouveaux outils d'identification et d'étude de l'évolution des Listeria.

III. Régulation de l'expression des gènes de virulence de Listeria monocytogenes

Mise en évidence d'un ARN thermosenseur et de petits ARN non codants (J. Johansson, P. Mandin)

La protéine PrfA est un activateur pléiotrope de la transcription de la majorité des gènes de virulence. Son expression est élevée à 37°C et inhibée à 20°C. Dans certaines conditions environnementales, la protéine est présente sous forme inactive. Nous avons montré que, à 20°C, mais pas à 37°C, la partie 5' de l'ARNm codant PrfA forme une tige et boucle qui séquestre la séquence Shine et Dalgarno et empêche la traduction des transcrits prfA. Parallèlement, nous avons démarre l'étude des ARN non codants et de leur rôle dans la régulation.

Analyse transcriptomique du régulon PrfA (E. Milohanic en collaboration avec C. Buchrieser et P. Glaser, Laboratoire de Génomique des Microorganismes Pathogènes, et la Génopole)

L'analyse transcriptomique des gènes régulés par PrfA dans différents milieux de culture nous a permis d'identifier 3 groupes de gènes comprenant respectivement 10 gènes déjà connus et deux nouveaux gènes directement activés par PrfA (Groupe I), 8 gènes régulés négativement (Groupe II) et 53 gènes sous le contrôle indirect de PrfA (Groupe III). L'addition de charbon au milieu de culture stimule l'expression des gènes du groupe I et abolit celle de la plupart des gènes du groupe III, alors que l' addition de cellobiose à l'effet inverse. Les gènes du groupe II sont réprimés quelles que soient les conditions. L'absence de boite PrfA et la présence de séquences similaires à des promoteurs dépendant du facteur sigma B en amont de certains gènes régulés par PrfA suggèrent qu'ils seraient contrôlés par un facteur sigma B qui contribue à la réponse au stress.

IV. Etudes in vivo de l'infection par L. monocytogenes et réponses de l'hôte

Rôle de InlA dans la traversée des barrières tissulaires (E. Huillet, M. Lecuit)

InlA interagit avec la E-cadhérine humaine ou de cobaye, mais pas avec celle de souris ou de rat. L'utilisation de souris transgéniques exprimant la E-cadherine humaine au niveau intestinal a révélé le rôle critique de InlA dans la traversée de la barrière intestinale par L. monocytogenes. Nous sommes en train de générer des souris transgéniques exprimant la E-cadhérine humaine en lieu et place de la E-cadhérine murine pour évaluer la contribution éventuelle de InlA dans la traversée des barrières hémato-encéphalique et fœto-placentaire (Collaboration avec C. Babinet, Unité de Biologie du développement, Institut Pasteur).

Réponses de l'hôte à l'infection par L. monocytogenes (O. Dussurget, M. Lecuit)

Nous avons entrepris une analyse globale de la réponse de l'hôte à l'infection par une approche transcriptomique (Collaborations avec J.I. Gordon, Université de Washington, St Louis, MO, et P. Ricciardi-Castagnoli, Université de Milano-Bicocca, Italie). Nous étudions la réponse intestinale de souris axéniques exprimant la E-cadhérine humaine au niveau intestinal et celle des cellules intestinales et dendritiques en culture. La comparaison des profils d'expression génique induits par les souches sauvage et mutantes de L. monocytogenes est en cours d'analyse

Analyse en temps réel de la listériose murine (O. Dussurget)

Nous venons de démarrer l'étude de l'infection par L. monocytogenes en temps réel par une technique non invasive d'imagerie basée sur la bioluminescence (Collaboration avec J. Hardy et C. Contag de l'Université de Stanford, CA). Cette approche devrait nous permettre de réaliser une analyse spatio-temporelle complète de la progression de la listériose murine.

V. Etudes épidémiologiques

(M. Lecuit en collaboration avec C. Jacquet, Centre de Référence des Listeria)

Certaines souches de L. monocytogenes expriment une forme tronquée de InlA, qui affecte leur capacité invasive. Une étude épidémiologique destinée à évaluer la fréquence et la distribution de ce type de souches a montré que 96% des souches cliniques et seulement 65% des souches d'origine alimentaire expriment une protéine InlA fonctionnelle. De façon frappante, la totalité des souches responsables d'infections materno-fœtales expriment une protéine InlA fonctionnelle. Ces résultats démontrent l'implication de InlA dans le développement de la listériose humaine et suggèrent fortement qu'elle ait un rôle critique dans la traversée de la barrière foeto-placentaire.

VI. Rickettsia conorii:

Un autre modèle pour l'étude des mouvements actine-dépendants et de l'entrée dans les cellules épithéliales (E. Gouin, J. Martinez, V. Villiers)

Comme L. monocytogenes, Rickettsia conorii, une bactérie intracellulaire stricte, possède une motilité dépendante de la polymérisation de l'actine. A l'inverse de L. monocytogenes, les filaments d'actine polymérisée par R. conorii sont longs, non branchés, fixés sur la bactérie. Le séquençage du génome de R. conorii a permis l'identification d'un gène rickA présent chez R. conorii et absent chez Rickettsia prowazekii, qui ne polymérise pas l'actine. Nous avons purifié la protéine RickA et montré qu'elle induit la polymérisation et le branchement de filaments d'actine in vitro. RickA est exprimée à la surface des bactéries intracellulaires. Nous avons aussi établi que le complexe Arp2/3 est présent autour des bactéries et uniquement à la base des comètes d'actine générées par R. conorii, suggérant un nouveau de polymérisation de l'actine. Parallèlement, nous analysons d'autres étapes non documentées de l'infection par R. conorii, telles que la nature des récepteurs ou la signalisation qui résulte de l'interaction de R. conorii avec les cellules épithéliales. Finalement, nous avons identifié une phospholipase D qui pourrait être un nouveau facteur de virulence puisque des anticorps spécifiques réduisent la cytotoxicité des Rickettsiae pour les cellules Vero (Collaboration avec D. Raoult, Unité des Rickettsies, Marseille, France).

Légendes des photos :

Photo 1. Schéma des facteurs et évènements impliqués dans l'entrée InlA-dépendante.

Photo 2. Schéma des facteurs et évènements impliqués dans l'entrée InlB-dépendante.

Photo 3. Photo du marquage de la myosine VIIa non conventionnelle (rouge), présente aux jonctions des cellules épithéliales et recrutée avec l'actine (vert) au site d'entrée de Listeria monocytogenes.

Mots-clés: bactéries, virulence, biologie cellulaire, transcriptome, mutagenèse


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