Unité: Typage et Séquençage des Virus des Hépatites

Responsable: Christian Bréchot, Valérie Thiers

Les travaux du laboratoire Mixte Necker/Institut Pasteur, Centre National de Référence sur les Hépatites virales B et C, sont centrés sur la mise en place de nouvelles approches méthodologiques pour l'analyse des infections par les virus des hépatites B (VHB) et C (VHC). Les virus B et C représentent en Europe les principaux agents impliqués dans la survenue du carcinome hepatocellulaire (CHC). En étroite collaboration avec l'unité mixte Inserm 370/Pasteur, nous développons un projet ambitieux ayant pour objectif d'étudier chez des sujets infectés par le VHC le profil d'expression genique (transcriptome et protéome) d'hépatocytes isolés par microdissection laser, afin d'identifier les mécanismes conduisant à terme au développement d'un CHC. Parallèlement, le Centre de Référence contribue à la surveillance moléculaire et à l'identification des risques résiduels de transmission de ces virus.

Le VHC est un des facteurs important influençant la survenue du carcinome hépatocellulaire (CHC). L'identification des gènes dont l'expression est modulée lors des différentes étapes de l'infection chronique par le VHC, est essentielle pour la compréhension des mécanismes conduisant à terme au développement d'un CHC et pour l'identification de nouveaux marqueurs diagnostiques et/ou pronostiques.

L'approche de référence repose sur l'analyse du transcriptome et du protéome de fragments hépatiques de patients infectés par le VHC. Cependant, le foie est un tissu hétérogène, dont l'architecture et la cellularité sont profondément modifiées au cours de ce processus pathologique. Par conséquent, le profil d'expression différentiel déterminé à partir d'un fragment hépatique total ne reflète pas strictement l'expression du génome hépatocytaire. La disponibilité de microscopes couplés à un laser permet d'isoler à partir des coupes histologiques congelées de tissu, des groupes d'hépatocytes.

1 Etude des variants de la capside du VHC, protéine virale potentiellement impliquée dans la carcinogenèse (R. SOBESKY, V. THIERS).

La protéine de capside du VHC participe à la formation de la particule virale. Elle régule également l'expression de plusieurs gènes cellulaires, impliqués entre autre dans la prolifération et la viabilité cellulaire. Le VHC est caractérisé par une variabilité génétique répartie sur tout le génome, résultat de l'absence d'activité de relecture de la polymérase virale. Cette hétérogénéité virale est à l'origine de sa persistance et de sa résistance au traitement antiviral. L'accumulation de mutations ponctuelles dans la protéine de capside au cours de la réplication du génome viral, pourrait modifier les propriétés biologiques de cette protéine. De fait, chez un petit nombre de patients présentant un CHC, il a été montré que les séquences de capside isolées dans la partie tumorale du foie diffèrent de celles isolées dans la contrepartie non-tumorale. De plus, il a été montré que ces différentes capsides présentent des propriétés biologiques différentes (Delhem et al, 2001, Oncogene). L'objectif du travail est donc d'étendre cette observation sur un plus grand nombre de sujets. Nous effectuerons une analyse comparative de séquences du gène codant pour la protéine de capside du VHC, isolées à partir de groupes d'hépatocytes microdisséqués dans les zones tumorales et non tumorales d'un même échantillon. Nous disposons d'une dizaine de couples T/NT de sujets atteints de CHC et la séquence de deux couples T/NT a été déterminée.

2. Etude du transcriptome des hépatocytes stéatosiques isolés par microdissection au cours de l'infection chronique par le VHC (JB TRABUT, R. SOBESKY, V. THIERS)

L'infection par le VHC est caractérisée par l'observation fréquente d'une stéatose macro-vésiculaire chez les sujets porteurs d'une infection chronique (50%). Cet aspect histologique particulier n'est pas observé chez les sujets porteurs chronique du VHB. Les données de la littérature suggèrent que la stéatose pourrait, au moins dans certains cas, favoriser le développement de la fibrose hépatique et ainsi contribuer à la constitution de la cirrhose, puis au développement d'un CHC. Les mécanismes impliqués dans le développement de la stéatose chez les sujets infectés par le VHC sont mal connus. Notre projet à pour objectif de mieux définir les mécanismes impliqués dans la présence d'une stéatose chez ces patients. Nous allons, après hybridation sur des puces généralistes (Affymetrix), comparer le profil d'expression genique d'hépatocytes stéatosiques à celui d'hépatocytes morphologiquement normaux, sélectionnés par microdissection à partir de biopsies hépatiques de sujets chroniquement infectés par le VHC. Nous avons développé et validé sur puce test les conditions expérimentales nous permettant d'obtenir des ARN totaux de bonne qualité issus d' hépatocytes isolés par microdissection. En collaboration avec le service d'Hépatologie de l'hopital Necker, des biopsies hépatiques de sujets chroniquement infectés par le VHC, avec et sans stéatose, ont été sélectionnées et sont en cours d'analyse. (Projet subventionné par le Ministère de la Recherche et réalisé en collaboration avec la Génopole de Strasbourg).

3 Analyse du protéome de patients atteints de CHC à partir d'hépatocytes isolés par microdissection (A. DOS SANTOS, F. DEMAUGRE & V THIERS)

Notre projet, est centré sur l'étude comparative des protéomes d'hépatocytes tumoraux et non-tumoraux d'hépatocytes sont isolés par microdissection laser, à partir de coupes histologiques congelées. L'approche repose sur l'association de l'électrophorèse bi-dimensionnelle (2D-PAGE) et de la spectrométrie de masse pour identifier les protéines différentiellement exprimées dans le CHC lié au VHC. L'objectif à terme de cette étude est d'utiliser les données obtenues dans cette investigation, pour définir de nouveaux outils diagnostiques et/ou thérapeutiques pour le traitement du cancer du foie chez les patients atteints d'hépatite C (projet ARECA - ARC/Inserm).

Nous avons défini les conditions méthodologiques permettant de réaliser une 2D-PAGE informative sur des hépatocytes isolés par microdissection laser et validé l'ensemble de la procédure expérimentale par une identification en spectrométrie de masse de "spots" protéiques sélectionnés (collaboration avec l'unite Inserm U467. et CNRS UMR7637). Les tests de validation de notre procédure étant satisfaisants nous allons débuter l'analyse des patients. Les fragments tissulaires inclus dans cette étude ont été obtenus de la Collection Nationale des hépatocarcinomes (subventionnée par l'Inserm/DHOS). Par ailleurs les extraits protéiques ainsi obtenus à partir d'hépatocytes microdisséqués seront également évalués à l'aide du système SELDI-TOF qui est mieux adapté que la 2D-PAGE à l'analyse des protéines de faible poids moléculaire (collaboration avec l'unité CNRS ESA 8067).

4 Activité du CNR Hepatites virales B et C (F. RIMLINGER, V. THIERS)

Les projets de recherche du laboratoire mixte sont également associés aux activités menées par le CNR. Les données moléculaires, par l'intermédiaire d'analyses phylogénétique, sont utilisées pour " tracer " l'origine de certaines infections virales et permettent d'affirmer ou d'infirmer des hypothèses concernant les modes de transmission. Des études visant à l'analyse des modes résiduels de transmission des VHB et VHC sont en cours : Investigation d'épisodes transmission nosocomiale en collaboration avec l'Institut de Veille Sanitaire ; étude de l'épidémiologie moléculaire du virus de l'hépatite C dans des zones géographiques diverses en collaboration avec le réseau HEPMED (projet CEE) et le réseau des Instituts Pasteur (PTR coordonné par Pénélope Mavromara, IP de Grèce) et de l'hépatite B en Tunisie, (IP Tunis, P. H. Triki).

Mots-clés: Epidémiologie moléculaire, VHB; VHC, microdissection laser, proteome, transcriptome, steatose, CHC


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