Unité: Hépacivirus

Responsable: MEURS Eliane

L'objectif de cette Unité Postulante est d'étudier l'interaction du virus de l'hépatite C (VHC) avec sa cellule-hôte et son impact sur les défenses antivirales de la cellule. Il n'existe actuellement pas de modèle cellulaire pour cultiver le VHC in vitro. Ce virus est toutefois capable d'infecter différentes cellules, d'origine hépatocytaire ou hémopoietique, mais avec une très faible efficacité. L'Unité a donc développé une stratégie permettant la sélection et l'enrichissement des cellules infectées par le VHC ex vivo. Elle s'est concentrée sur la purification des hépatocytes primaires infectés. Ce matériel sera utilisé pour connaître l'impact du VHC sur l'expression des gènes cellulaires (par exemple, par analyse des transcriptomes). L'infection par le VHC peut affecter la réponse immune innée de l'hôte et inhiber, en particulier, le mécanisme d'induction de l'IFN. L'Unité recherche les moyens de restaurer une réponse immune innée efficace, en étudiant l'interaction du virus avec les voies de signalisation impliquées dans l'induction de l'IFN.

Identification et purification des cellules infectées par le VHC

(Collaborations avec Patrick Maurel, INSERM U-128, & Joliette Coste, EFS, Montpellier; Gilles Duverlie; Université de Picardie-Jules Verne, Amiens ; Ceslaw Wychowski, groupe Hepatite C (CNRS, FRE 2369), Institut de Biologie de Lille & Institut Pasteur de Lille ; Pierre Charneau, Virologie Moléculaire et Vectorologie, Institut Pasteur,Paris; Haralabia Boleti, laboratoire de Virologie Moléculaire, Institut Pasteur Hellénique; Athènes; Grèce).

Le virus de l'Hépatite C (VHC) infecte 3% de la population mondiale et provoque le développement d'hépatites chroniques dans 60 à 90% des patients infectés, pouvant conduire à des cirrhoses (0,5 à 30% des cas) et des carcinomes hépatocellulaires. C'est un virus enveloppé (famille des Flaviviridae; genre hépacivirus) dont le génome à ARN positif présente une forte hétérogénéité (6 génotypes distincts; différents sous-types et quasi-espèces). Actuellement, il n'existe pas de système de culture efficace et reproductible permettant l'amplification de particules virales, ce qui handicape les études sur ce virus. Cependant, même à très faible efficacite (moins de 1%), le VHC est tout de même capable d'infecter certaines cultures cellulaires, dont des cultures primaires d'hépatocytes humains, son hôte cellulaire naturel. Aussi, nous avons défini une stratégie visant à identifier et trier les cellules infectées par le VHC à partir de l'ensemble des cellules incubées avec un sérum infectieux. Pour cela, nous avons construit, puis inséré dans différents vecteurs d'expression eucaryote, des "outils moléculaires" qui ne s'activent qu'en présence du VHC et qui permettront de révéler les cellules infectées ou de les purifier. Cette approche sera utilisée pour (1) caractériser l'action du VHC sur les voies de signalisation des cytokines, (2) effectuer une analyse comparative du transcriptome des hépatocytes infectés et non infectés, traités ou non à l'interféron (IFN), une des cytokines impliquées dans la réponse immune innée et (3) établir l'impact de de certaines protéines cellulaires ou virales sur la réplication du virus.

Mécanisme d'action de la PKR, une protéine kinase induite par l'interféron.

La PKR, ou Protéine Kinase dépendante d'ARN bicaténaire, est une protéine présente dans la plupart des cellules. Son expression est fortement induite en réponse au traitement par l'IFN et elle joue un rôle important dans les mécanismes de défenses antivirales au niveau cellulaire. La PKR s'active en kinase lorsqu'elle se lie à des structures d'ARN bicaténaires. De telles structures apparaissent fréquemment dans les cellules au cours d'une infection virale (génomes viraux présentant des ARNs double brin, formes intermédiaires de réplication, etc). Une fois activée, la PKR provoque l'arrêt des synthèses protéiques, en phosphorylant son substrat (eIF2α ), une sous-unité d'un facteur cellulaire essentiel pour le démarrage de la traduction des ARNs messagers en protéines. Ainsi, en bloquant la synthèse protéique de la cellule infectée, l'action de la PKR participe à l'arrêt de la propagation virale dans l'organisme. Paradoxalement, la PKR agit également de façon positive sur l'expression de certains gènes, notamment en soutenant l'induction du gène de l'IFN. Pour cela, la PKR n'utilise pas sa fonction kinase mais entre directement en contact, par sa partie N terminale, avec une voie de signalisation conduisant à l'activation du facteur de transcription NF-κ B. Par ces deux mécanismes, la PKR participe donc de façon importante à l'action antivirale de l'IFN: 1) en bloquant les synthèses protéiques dans la cellule infectée, 2) en participant aux mécanismes d‘induction de l'IFN via l'activation de NF-κ B, ce qui renforce la protection des autres cellules.

Régulation positive de la traduction par TRBP de façon dépendante et indépendante de la PKR (collaboration avec Catherine Vaquero, INSERM U511, Hôpital La Pitié-Salpêtrière; et Anne Gatignol; Lady Davis Institute for Medical Research,; Montreal)

TRBP (HIV-1 transactivating response (TAR) RNA Binding Protein) est une protéine cellulaire qui, comme la PKR, peut se lier à des structures d'ARN bicaténaires. Son ADNc a été initialement isolée d'une banque d'expression sondée par l'ARN TAR, une région ARN bicaténaire présente en amont de tous les transcrits du VIH-1, le virus de l'Immunodéficience Humaine. Nous nous intéressons à la protéine TRBP car elle forme des hétérodimères avec la PKR, au niveau de leurs domaines respectifs de liaison aux ARNs bicaténaires. Elle se conduit alors comme un inhibiteur de la fonction kinase de la PKR et peut donc gêner l'action antivirale de l'IFN. Des expériences de traduction in vitro dans des lysats de réticulocytes de lapin mettent facilement en évidence ce pouvoir inhibiteur de TRBP sur la PKR. Dans un tel système, des ARNs messagers possédant une structure à ARN bicaténaire en amont de leur séquence codante se traduisent très mal et activent la PKR, ce qui peut être révélé par la phosphorylation d'eIF2α (voir § sur PKR). L'addition de TRBP à ce système restaure l'efficacité de traduction et inhibe la phosphorylation d'eIF2α . Nous avons mis en évidence que TRBP, outre son rôle inhibiteur de PKR, joue également un rôle stimulateur direct de la traduction de ces ARNs messagers, par son interaction avec l'ARN bicaténaire. L'action de TRBP serait de permettre une déstabilisation des structures à ARN bicaténaires et de favoriser leur accès aux ribosomes puis leur traduction. TRBP agit donc comme un facteur cellulaire important pour la traduction des ARNs messagers contenant des structures bicaténaires, à la fois en inhibant la PKR et de façon indépendante de la PKR. Dans le contexte d'une infection virale, il est donc crucial de connaitre les actions relatives de PKR et de TRBP afin de pouvoir augmenter le pouvoir antiviral de PKR (Dorin et al, 2003, J Biol Chem).

Mots-clés: Virus de l’Hépatite C, cytokines, voies de signalisation, PKR, Virologie


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