Unité: Génétique Moléculaire Murine - URA CNRS 2578

Responsable: Philip AVNER

L'activité de l'unité est organisée autour de trois thématiques :

1) L'Epigénétique : l'inactivation du chromosome X chez la souris

2) La Génétique : l'analyse du diabète de type 1 chez la souris comme modèle pour des caractères sous contrôle multifactoriel et polygénique

3) Les cellules souches : le rôle du gène Nap1l2, lié au chromosome X, dans le contrôle de la division cellulaire des cellules neuronales et la prolifération des cellules souches neuronales

1) L'inactivation du chromosome X

L'inactivation du chromosome X, phénomène biologique extrêmement complexe, qui est l'un des paradigmes pour les processus sous contrôle épigénetique, est l'une des préoccupations majeures de l'Unité de Génétique Moléculaire Murine.

L'initiation de l'inactivation, qui dépend du locus Xic (X-inactivation centre), inclut un processus qui permet le comptage du nombre de chromosomes X dans chaque cellule par rapport au nombre d'autosomes. Ainsi, dans une cellule diploïde porteuse de plusieurs chromosomes X, seul un chromosome X reste actif, tous les autres sont inactivés. Le processus d'inactivation dépend de la présence du gène Xist qui assure la présence d'un ARN non-codant qui décore l'X inactif. L'étude moléculaire de Xic le laisse apparaître, de plus en plus clairement, comme un complexe d'éléments distincts associés à Xist et capable d'assurer les étapes précoces de l'inactivation. Si plusieurs loci, incluant le locus Xce (X-controlling element), sont connu pour affecter le choix ou la probabilité que l'un ou l'autre des chromosomes X soit inactivé, peu de choses sont connues sur les éléments impliqués dans le comptage.

Nous avons, en 2003, poursuivi la caractérisation fonctionnelle des éléments en 3' de Xist, au sein du Xic, par une double approche basée d'un coté sur la mutagenèse ciblée conditionnelle en utilisant le système Cre-lox et de l'autre, sur une stratégie de complémentation de délétions préexistantes. Des mutations ont été obtenues à la fois dans les lignées ES femelle, permettant l'analyse du choix, des lignées ES mâle, et l'analyse du phénomène de comptage. En effet une mutation dans le système de comptage peut se manifester dans des cellules mâles par l'inactivation du chromosome X en l'absence d'un deuxième chromosome X. Cette double approche a permis d'effectuer des progrès notables dans notre compréhension des éléments génétiques mis en jeu dans le comptage, le choix ainsi que dans la régulation de Xist. Le (ou les) élément (s) du comptage résidera (ront) dans une région de 20kb située immédiatement en 3' de Xist. L'analyse de séquences comparées précédemment entamée, et actuellement en train d'être approfondie, devrait nous aider dans l'identification de candidats éventuels. Nous avons pu démontrer d'autre facettes du rôle de l'antisens à Xist, Tsix. Ainsi l'expression de Xist, la diffusion ou la rétention de l'ARN de Xist à son site de transcription et l'état de l'ouverture de la chromatine dans la région promotrice de Xist semblent tous être contrôlés par Tsix et la région en 3' de Xist.

Nous avons entamé des analyses plus poussées de la partie du Xic en 5' de Xist. En effet, cette région a été définie par des expériences de ChIP (Chromatin Immunoprecipitation), comme un centre éventuel de nucléation permettant à l'inactivation de s'étendre le long du chromosome X à partir du Xic dans les toutes premières étapes de l'inactivation. Nous avons continué notre caractérisation de cette région pour la présence de diverses modifications d'histones et la présence d'autres régulateurs de transcription. Un rapprochement de ces données épigénétiques avec les données de séquençage génomique a été effectué permettant d'identifier une sous-région d'importance particulière, qui sera caractérisée par déletion génétique.

Enfin, des facteurs génétiques situés hors du Xic et vraisemblablement en dehors du chromosome X, impliqués dans le processus d'inactivation, ont été recherchés à travers leur transcrits, par une analyse comparée de transcriptomes entre les embryons femelles et les embryons mâles de 6,5 jours post-coïtum, en utilisant la méthode SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Un tri important des séquences candidates a été effectué pour identifier les candidats les plus prometteurs. Du RNAi a été utilisé pour démontrer de façon définitive le rôle de certaines de ces séquences dans la mise en place et/ou le maintien de l'inactivation du chromosome X.

Recherche sur les génomes et les modèles murins des maladies humaines

L'analyse du diabète de type 1 chez la souris

L'Unité de Génétique Moléculaire Murine a entrepris d'utiliser la souris comme modèle pour l'étude des phénotypes sous contrôle polygénique et multifactoriel. La lignée NOD représente un modèle de diabète insulino-dépendant et son étude vise à définir les facteurs génétiques impliqués dans le développement de cette pathologie (Idd) qui est connue pour dépendre à la fois de facteurs génétiques et liés à l'environnement. Nos études sont concentrées sur la caractérisation de loci de contrôle situés sur la partie distale du chromosome 6 murin. Nous avons fait des progrès importants en 2003 dans l'affinement de la localisation génétique du locus Idd6 grâce à la construction de quatre nouvelles souches de souris congéniques de plus et plus restreintes pour les régions distales du chromosome 6 ainsi que la recherche de gènes candidats dans la région candidate ainsi définie pour Idd6. La caractérisation immunologique des lignées congéniques et en particulier les expériences de transfert, ont facilité la définition du site d'action d'Idd6 ainsi que la recherche du gène candidat par analyse transcriptionnelle et mutationnelle. Les tests fonctionels de ces gènes ont été entamé par une approche de RNAi.

Le rôle du gène Nap1l2

Une autre maladie sous contrôle génétique complexe et sujette à des effets environnementaux importants est le spina bifida - maladie congénitale liée à l'absence de fermeture complète du tube neural au cours de l'embryogénèse. Parmi les gènes impliqués, nous avons pu mettre en évidence le gène Nap1l2 lié au chromosome X. Des mutations dans ce gène chez la souris sont associées à une léthalité embryonnaire, spina bifida et exencéphalie. L'absence de fermeture complète du tube neural est fort probablement liée à la surprolifération des tissus neuronaux ainsi induits. Nous avons pu récemment introduire des mutations conditionnelles dans le gène Nap1l2 dans les cellules ES et établir des lignées de souris transgéniques pour la mutation. Ces lignées devraient permettre de définir pour la première fois, le rôle et les mécanismes d'action de Nap1l2 chez des souris adultes. L'établissement d'un système de différentiation efficace des cellules ES en cellules souches neuronales a, d'autre part, ouvert des perspectives très intéressantes pour l'étude détaillée des interactions et du rôle de Nap1l2 dans les cellules souches neuronales.

Mots-clés: Epigénétique, Inactivation du chromosome X, Chromatins, Génétique, Génomique, Diabète de type 1, Souris, QTL, Caractère sous contrôle multigénique, Cellules souches


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