Unité: Génétique Moléculaire du Développement - URA CNRS 2578

Responsable: Margaret BUCKINGHAM

Nos recherches sont centrées d'une part sur l'étude de la myogenèse dans le but de comprendre comment les cellules progénitrices sont spécifiées chez l'embryon pour permettre la mise en place de différentes masses musculaires du squelette. Nous sommes également intéressés par les cellules progénitrices du muscle chez l'adulte et l'éventuelle contribution de cellules souches à la régénération. D'autre part, nous étudions la cardiogenèse avec l'analyse des différentes populations précurseurs du myocarde et leur contribution à la morphogenèse du cœur. Le modèle expérimental est la souris, manipulée par les approches de génétique moléculaire.

La formation du muscle de squelette

Les gènes Myf5 et Pax3 se situent en haut de la hiérarchie génétique qui détermine l'entrée d'une cellule dans la voie de différenciation musculaire. Myf5 est un membre de la famille de facteurs de régulation myogénique (Myf5, Mrf4, MyoD, Myogénine) tandis que Pax3 appartient à la famille des facteurs de transcription à boîte homéo, les Pax, dont différents membres jouent un rôle clé dans l'apparition de cellules spécialisées, tels les lymphocytes B, pendant le développement.

La régulation du gène Myf5

[Lola Bajard, Ted Chang, Philippe Daubas, Didier Rocancourt, Ralf Spörle [Collaboration avec le laboratoire de P. Rigby (Londres)].

Nous étudions la régulation du gène Myf5 dans le but de comprendre comment ce gène de détermination myogénique est activé chez l'embryon. Par une approche transgénique, en utilisant les YACs portant de grands fragments d'ADN, nous avons mis en évidence différentes régions, allant jusqu'à - 96 kb en amont de Myf5 qui contrôlent l'expression spatio-temporelle du gène. En particulier, une séquence située entre -58/-48 kb est composée de plusieurs éléments qui ciblent spécifiquement les sites de transcription de Myf5 dans les somites et les membres ainsi que dans les régions du système nerveux central où la protéine n'est pas détectable. La délétion de cet enhanceur, dans le contexte du locus, montre son rôle essentiel. Cette analyse révèle la multiplicité de séquences qui se complémentent pour orchestrer la formation du muscle. Nous recherchons actuellement les activateurs de telles séquences.

Le fonctionnement de Pax3

(Mounia Lagha, Frédéric Relaix, Didier Rocancourt [Collaborations avec B. Schafer (Zurich), C. Ponzetto (Turin) et Ahmed Mansouri (Göttingen)].

Chez les mutants splotch, le gène Pax3 est atteint et plusieurs masses musculaires sont absentes, dont celles des membres. Le ciblage du gène Pax3 par le gène rapporteur nlacZ nous a permis de suivre les cellules qui expriment le gène. Pax3 lui même est peu actif comme facteur de transcription et la question de son rôle comme activateur ou répresseur chez l'embryon se pose. Chez l'homme, une translocation chromosomale crée une protéine de fusion PAX3-FKHR, impliquée dans la formation de rhabdomyosarcomes. Cette protéine, qui garde le domaine de fixation à l'ADN de PAX3, avec le domaine de transactivation de FKHR, est un puissant activateur de la transcription. Nous avons ciblé un allèle de Pax3 avec la séquence PAX3-FKHR-IRESnlacZ et démontré ainsi que la protéine PAX3-FKHR fonctionne comme Pax3, et peut sauver le phénotype du mutant Pax3-/-, à la fois au niveau du muscle et de la crête neurale . Pax3 est donc un activateur de la transcription chez l'embryon, conclusion confirmée par l'expression d'un transgène régulé uniquement par les sites de liaison pour Pax3. Les souris qui expriment PAX3-FKHR nous permettent de démontrer que MyoD et c-met sont effectivement les cibles et que Pax3 a aussi une action anti-apoptique, la perte de cellules en l'absence de Pax3 rendant cette conclusion délicate chez le mutant null. La surexpression de c-met provoque une délamination ectopique de précurseurs musculaires à partir des somites thoraciques, avec l'activation de ce récepteur en absence du ligand HGF - phénomène d'intérêt embryologique et aussi dans le contexte de la tumorigenèse. Nous recherchons actuellement d'autres cibles de Pax3 en utilisant les mutants gain et perte de fonction que nous avons créés.

Le muscle adulte

(Didier Montarras, Frédéric Relaix, Didier Rocancourt) [Collaboration avec A. Cumano (IP) et T. Partridge, Londres)].

Les cellules satellites qui se trouvent le long des fibres musculaires sont les précurseurs du muscle adulte. Pax7, l'orthologue de Pax3, joue un rôle important dans ces cellules. Les souris Pax3-nlacZ nous ont permis de démontrer que Pax3 est également exprimé dans les cellules satellites de certains muscles. En l'absence de Pax7, ces cellules satellite sont présentes et capables de se différencier en culture, mais en nombre réduit. La construction d'une souris Pax3-GFP rend possible la purification de cette population et l'étude du rôle de Pax3 chez l'adulte.

Les cellules souches-mesoangioblastes et l'aorte dorsale

(Milan Esner, Sigolène Meilhac, Didier Montarras) [Collaborations avec G. Cossu (Milan), A. Cumano (IP) et J.-F. Nicolas (IP)].

Plusieurs sources de cellules souches qui peuvent peupler le muscle ont été proposées, parmi lesquelles les mésoangioblastes provenant des parois de vaisseaux sanguins sont particulièrement intéressants. Nous étudions ces cellules qui expriment Pax3. Elles apparaissent d'abord dans l'aorte dorsale chez l'embryon et nous effectuons une étude de lignage avec un marqueur génétique qui nous permet de suivre les cellules de l'aorte aussi bien que les cellules musculaires des somites.

Cardiogenese

(Fany Bajolle, Milan Esner, Sigolène Meilhac, Emmanuel Pecnard, Stéphane Zaffran) [Collaborations principalement avec N. Brown (Londres), R. Kelly (New York) et J.-F. Nicolas (IP)]

La morphogenèse du cœur dépend de gènes de régulation dont les phénotypes des mutants n'affectent souvent, de façon inattendue, qu'un compartiment du cœur. Un autre paramètre important dans ce processus est cellulaire, et concerne à la fois l'origine et le comportement des cellules qui vont contribuer aux différentes parties du cœur. Dans le but d'aborder cette problématique, nous avons créé les souris α-actine cardiaque nlaacZ. Un événement de recombinaison rare dans une cellule, donne un allèle nlacZ, avec production de la β-galactosidase, permettant une analyse clonale rétrospective du myocarde dont toutes les cellules expriment ce gène. Nous avons d'abord constaté que les cellules d'un clone issu d'un événement de recombinaison plus ancien sont dispersées sur l'axe antérieur/postérieur du tube cardiaque. Ce résultat n'est pas compatible avec un modèle segmenté du cœur où chaque compartiment futur est pré-ordonné dans l'organisation des cellules mésodermales précoces. Par contre plus tardivement nous démontrons que les cellules d'un clone restent ensemble et qu'il y a donc une phase de croissance cohérente qui suit la phase dispersive (Figure 2 ). L'analyse de la croissance cohérente révèle que la forme de chaque compartiment cardiaque est préfigurée par une croissance orientée des cellules de la partie correspondante du tube cardiaque.

Cette analyse clonale nous a donné aussi des informations importantes sur l'origine des cellules du myocarde. Deux lignages peuvent être distingués ; les deux contribuent à toutes les parties du cœur sauf, dans le cas du premier à la voie efférente et, dans le cas du deuxième au futur ventricule gauche. Ces résultats sont à mettre en rapport avec notre démonstration d'une contribution inattendue de cellules du mésoderme pharyngé ("champ antérieur cardiaque") à la voie efférente du cœur. Récemment, avec une approche de culture d'explants du mésoderme pharyngé ou du tube cardiaque, provenant des souris transgéniques qui marquent les différentes parties du coeur, nous avons pu démontrer que la plupart du tube primitif cardiaque a une identité "ventricule gauche". Les cellules précurseurs du ventricule droit aussi bien que de la voie efférente, se trouvent dans le mésoderme pharyngé. Ces résultats sont appuyés par les expériences de marquage par DiI chez les embryons en culture.

Nos études en cours comportent une analyse plus fine de la morphogenèse de la voie efférente ainsi que la formation des oreillettes et leur identité droite/gauche. Nous nous intéressons également aux mutants qui affectent le myocarde dans le contexte des contributions cellulaires aux différentes parties du cœur que nous avons mis en évidence.

Photos :

Figure 1) PAX3-FKHR sauve le phénotype des mutants Pax3 (Sp).

A, C. Distribution normale de cellules β-galactosidase positives.

B. Perte des muscles des membres (tête de flèche noire) et anormalités des somites (tête de flèche rouge) en l'absence de Pax3. D. Restauration du phénotype montré en B, en présence de PAX3-FKHR.

Figure 2 Deux phases de croissance clonale dans le tube cardiaque à E8.5.

A. Un amas de cellules β-galactosidase positives montre une croissance cohérente.

B. Plusieurs amas de cellules β-galactosidase positives démontrent une phase de croissance dispersive des cellules progénitrices du myocarde.

Mots-clés: Myogenèse, Pax3, Myf5, Cardiogenèse, Lignages Cellulaires


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