Unité: Génétique des Interactions Macromoléculaires

Responsable: Jacquier Alain

Nous étudions divers aspects du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae utilisée comme modèle de cellule eucaryote. Durant l'année 2003 notre travail a en particulier porté sur : 1) l'étude du rôle des protéines Mlp dans la rétention des ARN non-épissés dans le noyau, 2) l'étude d'un nouveau mécanisme de régulation de la stabilité des ARN agissant directement sur l'étape de "décoiffage". 3) l'étude de la voie de maturation et d'export des particules ribosomiques et en particulier l'assemblage des complexes pré-60S.

La thématique générale du laboratoire est focalisée sur certaines étapes du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces voies métaboliques regroupent de nombreuses étapes qui vont de la transcription de ces molécules dans le noyau, jusqu'à leur dégradation dans le cytoplasme en passant par les étapes de maturation ainsi que le transport nucléocytoplasmique. Nous employons une démarche de type globale au départ, pour aboutir à une analyse spécifique de certains facteurs au final. Pour cela, nous utilisons différentes techniques génériques comme le double-hybride (ou le triple-hybride ARN), les purifications biochimiques par affinité (TAP) et des cribles génétiques (cribles de co-létalité par exemple) afin d'identifier la fonction de nouveaux facteurs impliqués dans ces voies métaboliques. La combinaison de ces trois approches génériques nous permet de cerner l'étape dans laquelle sont impliqués ces facteurs. Nous faisons alors une analyse classique de ces candidats en réalisant des tests fonctionnels spécifiques de l'étape identifiée afin d'affiner leur caractérisation.

Architecture nucléoplasmique et rétention des ARNm non-matures

Les protéines Mlp1 et Mlp2 forment des filaments intranucléaires localisés en périphérie du noyau. Nos données de cribles double-hybride nous avaient précédemment permis d'identifier la nucléoporine Nup60 comme étant l'un des points d'ancrage des protéines Mlp aux pores nucléaires. En collaboration avec le groupe d'Ulf Nehrbass à l'Institut Pasteur, nous avons maintenant montré que Mlp1 est impliquée dans la rétention des ARN pré-messagers non épissés ayant atteint la périphérie nucléaire. Ce mécanisme fait intervenir la reconnaissance de la séquence consensus en 5' des introns. En l'absence de la protéine Nup60, contexte dans lequel Mlp1 est délocalisée dans le noyau, la rétention des ARN pré-messagers dans le noyau est très fortement affectée. Ces observations définissent pour les protéines Mlp un rôle dans le contrôle de la qualité des transcrits avant leur export du noyau vers le cytoplasme ().

Dégradation régulée des transcrits

Un réseau de liens double-hybride suggérait qu'un nouveau facteur Edc3 était impliqué dans la dégradation des ARN messagers. Une analyse spécifique de ce facteur nous a permis de caractériser un nouveau mécanisme de régulation.

Moduler la vitesse de dégradation des ARNm est un moyen efficace et rapide de contrôler l'expression des gènes. Chez les eucaryotes, la dégradation des ARNm dans le cytoplasme fait intervenir la dégradation de la queue de poly(A) (déadénylation) suivie, dans la voie majeure de dégradation, de l'enlèvement de la coiffe ("décoiffage") en 5' des transcrits et de leur dégradation par une exonucléase 5'-3'. Dans la majorité des cas décrits jusqu'à présent, la modulation de ce processus s'effectue au niveau de la vitesse de déadénylation. Nous avons maintenant montré que la protéine Rps28b était capable d'autoréguler la dégradation de son propre transcrit par un nouveau mécanisme qui active son décoiffage en court-circuitant l'étape de déadenylation. Ce mécanisme requiert la présence du facteur Edc3, associé au complexe de décoiffage. Rps28b active le décoiffage de manière spécifique en interagissant à la fois avec Edc3 et un élément cis-régulateur conservé dans le 3'-UTR de son propre ARNm. Ces résultats démontrent que la régulation spécifique de l'étape de décoiffage de transcrits naturels est un mécanisme qui peut-être utilisé dans le contrôle de la stabilité des ARNm (Badis et al., soumis).

L'assemblage des complexes préribosomiques

La biogenèse des ribosomes fait intervenir des complexes macromoléculaires dont les mécanismes d'assemblage sont encore peu connus. Nous avons récemment déterminé (Saveanu et al., 2001; ), en même temps que d'autres groupes, la composition protéique globale de plusieurs complexes, dépassant le méga-Dalton, qui jalonnent la voie de biogenèse de la grande sous-unité ribosomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Une liste relativement exhaustive des facteurs préribosomiques associés de manière stable à ces différentes particules qui se succèdent a pu être dressée à partir de ces analyses protéomiques (). Pour comprendre maintenant les mécanismes qui régissent la dynamique d'assemblage des ribosomes, nous combinons plusieurs approches complémentaires. Approche protéomique: Nous purifions des complexes homogènes correspondant à des étapes successives de la biogenèse des ribosomes et nous identifions les composants protéiques de ces complexes. Approche génétique: A partir de ces analyses protéomiques, des candidats sont sélectionnés pour une analyse fonctionnelle. Nous réalisons des mutants thermo-sensibles de différents gènes essentiels. Ces mutants sont utilisés pour réaliser des cribles génétiques (cribles suppresseurs multicopies, cribles de léthalité synthétique, cribles double-hybride), ce qui nous permet d'identifier les partenaires fonctionnels de chaque facteur pré-ribosomique étudié. Nous avons pu montrer dans un certain nombre de cas, que les liens génétiques peuvent résulter d'un lien physique entre les partenaires (voir par exemple: ). L'identification de liens directs entre ces différents partenaires est un premier pas vers la compréhension du mode d'action coordonné de ces facteurs pré-ribosomiques. La combinaison de ces deux types d'approche, globale et centrée sur certains composants, devrait apporter des informations sur l'ordre de formation des complexes pré-ribosomiques et permettre d'identifier des protéines spécifiques d'une étape donnée, qui pourraient jouer un rôle régulateur.

Mots-clés: ARN, Saccharomyces cerevisiae, noyau, nucléole, ribosome


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