Unité: Génétique Mycobactérienne

Responsable: GICQUEL Brigitte

Causée par les mycobactéries du complexe tuberculosis, la tuberculose continue de poser un problème majeur de santé publique : elle est responsable d'environ trois millions de morts par an. Le BCG, seul vaccin disponible actuellement contre cette maladie, est d'une efficacité relative. Quant à l'utilisation des antibiotiques, elle se heurte à l'apparition de souches résistantes. Dans ce contexte, l'Unité de Génétique Mycobactérienne s'intéresse à la caractérisation des facteurs de virulence de Mycobacterium tuberculosis et aux réponses immunitaires induites par cette bactérie et le BCG. Ces études pourraient conduire à l'identification de cibles thérapeutiques pour de nouveaux agents antituberculeux, et de composants de la bactérie susceptibles d'entrer dans la composition de nouveaux vaccins, voire d'une souche atténuée plus efficace que le BCG. L'unité étudie également la possibilité d'utiliser des souches de BCG portant des gènes étrangers pour protéger contre d'autres maladies, telles que le SIDA. Enfin l'Unité identifie des marqueurs génétiques spécifiques de souches particulièrement épidémiques, en particulier celles qui sont responsables d'épidémies de tuberculose à bacilles multirésistants.

Etude génétique des déterminants de la virulence (M. Jackson, O. Neyrolles, B. Gicquel)

L'utilisation d'un vecteur thermosensible dérivé du plasmide de Mycobacterium fortuitum pAL5000 et contenant le marqueur de contre-sélection sacB (vecteur Ts/sacB) a permis de construire et d'isoler des mutants d'échange allélique et de transposition chez les mycobactéries du complexe de Mycobacterium tuberculosis. Grâce à l'outil Ts/sacB, une banque ordonnée de 4000 mutants a été obtenue par la technique de mutagénèse par transposition étiquetée ou "STM" ("signature-tagged transposon mutagenesis"), et criblée pour rechercher directement chez la souris des souches atténuées pour la virulence. Environ 2000 souches ont été criblées pour leur capacité à se multiplier dans les poumons de souris durant la phase aiguë de l'infection. Seize mutants atténués ont été sélectionnés et les mutations qu'ils portent ont été caractérisées. Plusieurs des insertions différentes sont localisées dans un groupe de gènes impliqués dans la biosynthèse et le transport de lipides complexes de l'enveloppe de M. tuberculosis: les dimycocérosates de phtiocérol (DIM). Une étude portant sur le rôle de ces lipides dans la pathogénèse a révélé que la présence de DIM dans l'enveloppe de M. tuberculosis protège cette bactérie de l'action bactéricide des dérivés toxiques de l'azote produits par les macrophages activés et module la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection. C'est sans doute la combinaison de ces deux effets qui permet aux souches de M. tuberculosis productrices de DIM de se multiplier plus efficacement chez la souris aux stades précoces de l'infection. Nous nous intéressons également à d'autres mutants isolés par la technique STM, en particulier ceux présentant des déficiences dans la synthèse d'autres composés lipidiques de l'enveloppe. En outre, nous avons construit par échange allélique des mutants de M. tuberculosis déficients dans la synthèse de lipides spécifiques aux espèces pathogènes de mycobactéries et présentant certaines similarités structurales avec les DIM. L'étude de ces mutants dans des modèles cellulaires et animaux nous a permis de mesurer la contribution de ces différents lipides à la pathogénicité de M. tuberculosis. De nouveaux modèles de criblage des banques de mutants de transposition sont en cours de développement. Ils devraient permettre d'isoler d'autres souches atténuées de M. tuberculosis présentant des mutations dans des gènes jouant un rôle important dans les phases plus tardives de l'infection, ainsi que dans le parasitisme des macrophages.

L'intérêt vaccinal des souches atténuées de M. tuberculosis est étudié dans la cadre du "TB vaccine cluster" de la commission européenne coordonné par le Prof. Brigitte Gicquel (http://www.pasteur.fr/EC_TBvaccine/).

Interactions entre M. tuberculosis et les phagocytes (O. Neyrolles, M. Jackson, B. Gicquel)

Afin de mieux comprendre les mécanismes du parasitisme des macrophages par M. tuberculosis, de nouvelles approches combinées de biologie cellulaire et de génomique fonctionnelle sont en cours de développement au laboratoire. En particulier des banques de mutants de M. tuberculosis sont en cours de criblage pour identifier des gènes mycobactériens impliqués dans l'inhibition de la maturation de la vacuole mycobactérienne dans les macrophages. Par ailleurs, nous étudions également les intéractions précoces entre les mycobactéries et les phagocytes humains. Nous avons ainsi montré récemment que M. tuberculosis, et d'autres bactéries du complexe "tuberculosis", utilise la lectine DC-SIGN pour entrer dans les cellules dendritiques humaines, et que le lipoarabinomannane (LAM), un lipoglycane abondant de la paroi mycobactérienne, est un ligand de DC-SIGN. Nous avons également montré que DC-SIGN est exprimé sur les cellules dendritiques pulmonaires humaines et nous avons pu détecter des antigènes mycobactériens dans des cellules dendritiques exprimant DC-SIGN dans des ganglions de patients tuberculeux, indiquant que les mycobactéries intéragissent probablement avec la lectine in vivo. Par ailleurs, nous avons caractérisé les déterminants moléculaires de l'intéraction entre M. tuberculosis et DC-SIGN et nous avons pu ainsi expliquer pourquoi DC-SIGN ne reconnaît que les mycobactéries du complexe "tuberculosis". Ce résultat indique que ces pathogènes ont probablement évolué récemment pour utiliser cette lectine.

Recherche de nouvelles cibles pour des médicaments anti-tuberculeux (M. Jackson, B. Gicquel)

Le phosphatidylinositol (PI) et les produits qui en sont métaboliquement dérivés comme les phosphatidylinositol mannosides (PIM), le lipomannane (LM) et le lipoarabinomannane (LAM) sont des phospholipides / lipoglycanes qui jouent un rôle important, tant dans la physiologie des mycobactéries que dans leurs intéractions avec l'hôte. La caractérisation des enzymes impliquées dans leur biosynthèse, en plus d'apporter des connaissances fondamentales sur la façon dont sont synthétisées ces molécules, pourrait permettre d'identifier des cibles pour le développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux.

Nous avons identifié chez M. tuberculosis un groupe de cinq gènes potentiellement impliqués dans les étapes précoces de la synthèse des PIM. Nous avons analysé la fonction de deux de ces gènes, pimA (Rv2610c) et Rv2611c et montré qu'ils codent respectivement une mannosyltransferase et une acyltransférase impliquées dans la synthèse des phosphatidylinositol mono-mannosides di- et tri-acylés. Nous avons développé des essais enzymatiques in vitro pour chacune de ces enzymes. Par le biais de la construction d'un mutant conditionnel thermosensible de M. smegmatis déficient dans l'expression du gène pimA, nous avons de plus montré que ce gène est essentiel à la survie de cette bactérie. Bien que l'acyltransférase Rv2611c ne soit pas une enzyme essentielle de M. smegmatis en raison de l'existence d'activités enzymatiques redondantes, une déficience en cette enzyme perturbe considérablement la croissance de M. smegmatis. La synthèse des phosphatidylinositol mono-mannosides et des PIM/LM et LAM qui en sont dérivés apparait donc être essentielle à la croissance des mycobactéries. PimA et potentiellement Rv2611c sont donc des cibles enzymatiques intéressantes pour le développement de nouveaux anti-tuberculeux. De plus, les essais enzymatiques in vitro que nous avons développés pourront servir de base au criblage à haut-débit d'inhibiteurs de ces enzymes.

Epidémiologie moléculaire de la tuberculose (Brigitte Gicquel)

Des marqueurs spécifiques de souches de M. tuberculosis davantage transmissibles et responsables d'épidémies, en particulier d'épidémies de tuberculose à bacilles multirésistants aux antibiotiques ont été recherchés en collaboration avec les équipes du réseau européen d'épidémiologie moléculaire de la tuberculose le Public Health Research Institute et les Instituts du réseau et Instituts associés. Des allèles particuliers des gènes de la famille mutT et ogt ont été identifiés chez les souches de génotype W-Beijing. Ces résultats suggèrent que ces souches particulièrement adaptées à l'hôte ont évolué grâce à l'acquisition de mutations dans des gènes de réparation de l'ADN qui ont conduit à des phénotypes mutateurs vraisemblablement transitoires. Ces allèles spécifiques des souches W-Beijing peuvent être utilisés pour la mise au point de diagnostics moléculaires identifiant les différentes branches de la famille W. Beijing. D'une façon générale le typage moléculaire des souches du complexe tuberculosis est effectué dans plusieurs régions pour définir les types majeurs et étudier leurs transmission. Des marqueurs spécifiques de génotypes majeurs sont en cours d'identification.

BCG et nouveaux vaccins (Nathalie Winter)

M bovis BCG est le seul outil prophylactique disponible pour lutter contre la tuberculose. Bien que très largement administré dans le monde, les mécanismes immunitaires de la vaccination -partiellement efficace- sont mal définis. Nous nous intéressons à la compréhension de ces mécanismes. Le vaccin étant administré chez l'homme par voie intradermique, un modèle d'injection du BCG dans le derme auriculaire de la souris est utilisé. En utilisant des souches de BCG recombinant exprimant des gènes rapporteurs, tels que ova ou egfp, les événements très précoces qui s'établissent après la vaccination sont étudiés. Des analyses en cytométrie de flux, en immunohistologie et des tests immunologiques nous permettent de définir quelles sont les cellules impliquées dans l'établissement de la réponse immunitaire dans le ganglion satellite drainant le site d'injection. Le rôle respectif des cellules dendritiques du derme et de l'épiderme mais aussi d'autres cellules inflammatoires telles que monocytes et polynucléaires neutrophiles est en cours d'évaluation.

Les interactions entre cellules dendritiques et M. tuberculosis ou BCG sont également étudiées in vitro dans le laboratoire et en collaboration avec d'autres partenaires. Nous avons ainsi récemment démontré le rôle immunomodulateur des molécules DIM dans la réponse inflammatoire des CD (Rousseau et al., Cell. Microbiol., in press).

Le BCG représente également un vecteur attractif pour le développement de vaccins recombinants notamment contre le SIDA. L'intégration des cassettes d'expression dans le choromosome de BCG permet d'obtenir des souches génétiquement stables in vivo. Les vecteurs dérivés du mycobactériophage Ms6 s'intègrent dans des gènes tRNAala différents chez M. smegmatis et le BCG. Cette observation nous permet de construire de nouveaux vecteurs ciblant plusieurs loci du chromosome du BCG dans le but de construire des souches multi-recombinantes. De nouveaux promoteurs induits dans les cellules présentatrices d'antigènes sont également à l'étude.

Photo
Dans le derme auriculaire de souris, dès 4 heures après l'inoculation du vaccin BCG (rBCG-egfp, vert), le ganglion drainant est envahi de cellules positives pour Ly6G (rouge).Ces cellules sont principalement des leucocytes polymorphonucléaires. Une colocalisation du BCG avec ces cellules est observée. L'influence de ces évènements précoces sur l'induction de la réponse T induite par le vaccn est à l'étude.

Mots-clés: Mycobactérie, pathogénicité, virulence, tuberculose, epidémiologie, vaccin


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