Unité: Biologie des Populations Lymphocytaires - CNRS URA 1961

Responsable: FREITAS Antonio

Les thèmes de recherche de l'UBPL sont :

L'étude des mécanismes homéostatiques contrôlant le nombre de cellules B et T

L'étude des mécanismes de survie lymphocytaire : les taux de production, de renouvellement et de mort lymphocytaire

L'étude du rôle de la compétition lymphocytaire dans la sélection et le contrôle des réponses immunes primaires et la mémoire immunologique

Homéostasie et sélection des cellules B (Emmanuelle Gaudin, Yi Hao): La tolérance B ou autoimmunité est déterminée par des évènements de sélection. La sélection négative des cellules B autoréactives est déjà bien établie. A l'opposé, la sélection positive des cellules B conventionnelles reste encore à déterminer. Nous avons montré que les cellules B autoréactives en cours de développement ne sont pas toujours fortement sensibles aux mécanismes de délétion imposés par les antigènes du soi sous forme membranaire. A de faibles taux, ces antigènes permettent la survie des cellules B autoréactives porteuses d'un seul récepteur des cellules B (BCR), de haute affinité. De façon plus importante, nous montrons que l'inclusion allélique (2 BCR) modifie le devenir des cellules B: de faibles quantités d'antigène du soi induisent la sélection et l'accumulation de nombres croissants de cellules B autoréactives avec une expression diminuée des BCRs spécifiques de l'antigène. En mesurant directement la force de liaison de l'antigène aux cellules B, nous montrons que de faibles quantités d'antigène du soi sélectionnent les cellules B autoréactives avec une constante d'association plus faible. Une partie de ces cellules B est activée et sécrète des auto-anticorps qui forment des complexes immuns circulants. Ces résultats montrent que les cellules B conventionnelles subissent une sélection positive et que le sort d'une cellule B réactive au soi dépend de la quantité d'antigène, du nombre de BCRs engagés et de l'avidité de sa liaison à l'antigène plutôt que de l'affinité des BCRs individuels.

Homéostasie et fonction des cellules T régulatrices CD4+CD25+ (Afonso Almeida). Nous avons établi que la voie IL-2/IL2R est indispensable à la production et/ou au maintien des cellules T CD4+CD25+ régulatrices (Almeida, A. et al, J. Immunol, 2002). Nous étudions actuellement le rôle in vivo de l'IL-2 sur la fonction des cellules T régulatrices. Afin d'étudier les sources possibles d'IL-2, nous avons établi par croisements de nouvelles lignées de souris dépourvues d'IL2 : CD25-/-IL2-/- et IL2-/-Ly5.1. Nous avons établi ces lignées soit sur un fond sauvage pour les utiliser comme donneuses de MO ou de cellules T CD4+ matures soit sur un fond Rag2-/- (lymphopéniques) ou CD3-/- (déficientes en cellules T) afin de les utiliser comme souris hôtes. Nous avons utilisé des souris lymphopéniques comme receveurs dans des expériences de reconstitution de MO ou de transferts de cellules T CD4+ matures périphériques. Nos premiers résultats sur les mécanismes de suppression de l'expansion des cellules T CD4+ naïves par les cellules T régulatrices excluent l'hypothèse de suppression par consommation de l'IL-2. Concernant l'homéostasie des cellules T régulatrices CD4+CD25+, nous avons obtenus par reconstitution de chimères de MO des résultats suggérant que l'IL-2 produite par les cellules T est nécessaire au maintien de la population de cellules T régulatrices. En parallèle, nous développons des tests de PCR quantitative "single-cell" pour étudier plus en détail ces populations cellulaires.

Rôle de l'IL- 7/ IL-7 récepteur dans l'homéostasie des cellules T (Jaime Franco). Les mécanismes contrôlant la taille du compartiment T périphérique ne sont pas encore totalement connus. Il a déjà été montré que l'IL-7 était impliqué dans la production et la survie des cellules T matures périphériques. Par conséquent, il est possible que l'IL-7 puisse aussi jouer un rôle sur la taille du compartiment T mature. Toutefois, la relation quantitative entre les taux d'IL-7 et les cellules T périphériques n'est pas encore établie. Nous avons mis au point un système expérimental permettant la production de cellules B et T dans des hôtes IL-7-/-Rag-/-, basé sur l'expression et la production renforcée d'IL-7. Ce système expérimental nous permettra d'étudier en détail les relations entre la dose disponible d'IL-7 et la production T ainsi que la taille du compartiment des cellules T périphériques. En utilisant ce système, nous pouvons aussi générer des cellules T matures produisant de l'IL-7 qui seront utilisées pour réguler le potentiel d'expansion et l'homéostasie des cellules T dans des hôtes Il-7-/-.

Prolifération des cellules T CD4+ induite par lymphopénie : régulation différentielle des protéines STAT 4 et 6(Vanesa Guajardo). Nous avons utilisé un modèle de prolifération induite par lymphopénie pour suivre le devenir des cellules T CD4+ marquées au CFSE obtenues à partir de donneurs Balb/c Stat6-/- et Stat4-/-. Nous avons trouvé que les cellules T Stat6-/- prolifèrent plus tôt et plus rapidement que les cellules T Stat4-/-. Malgré leur taux de croissance différentiel les deux types de cellules atteignent le même plateau en nombre (environ 2 x106 cellules/hôte). Lorsque les deux types cellulaires étaient co-transférés à des ratios cellulaires différents (1:3, 1:1, 3:1) dans les mêmes hôtes, les cellules T CD4+ Stat6-/- dominent les cellules T d'origine Stat4-/-. Nous avons analysé l'état de phosphorylation des protéines Stat pendant les 4 premiers jours après transfert. Nous avons observé que, dans les cellules T Stat6-/-, Stat4 était phosphorylé de façon transitoire et, à l'opposé dans les cellules T stat4-/-, Stat6 était diminué. Des résultats préliminaires par RT-PCR montrent que lors des 4 premiers jours de prolifération après transfert adoptif, l'ensemble des cellules présentent des taux accrus de T-bet et IFN-γ alors que le taux d'expression de mRNA Gata3 codant peu diminuaient. Nous avons aussi montré que l'IFN-γ était produit à la fois par les cellules T Stat6-/- et les cellules Stat4-/-. Ces résultats suggèrent que dans une situation de prolifération induite par lymphopénie, une réponse de type Th1 de réponses est induite en priorité.

Compétition et survie au sein du compartiment des cellules T CD4 mémoires (Sylvie Garcia). La compétition pour la survie entre cellules T mémoires est l'un des paramètres qui contrôlent la composition des compartiments mémoires. Le but de ce projet est de définir et de comparer les règles qui gouvernent les pools mémoires CD4 et CD8. Deux aspects de ces mécanismes seront explorés : 1- La compétition entre différentes sous-populations de cellules mémoires. 2- La capacité de cellules T CD4 mémoires nouvellement générées à entrer en compétition avec un pool de cellules CD4 mémoires préexistent. Ce processus impliquerait alors un appauvrissement qualitatif du pool de cellules mémoire (phénomène appelé " attrition "). Le premier point est étudié en co-transférant différents types de cellules T mémoires transgéniques pour différents TCR dans des souris hôtes immunodéficientes. Le deuxième point est testé par transferts adoptifs séquentiels de cellules T mémoires et naives transgéniques exprimant différents TCR dans des souris hôtes immunodéficientes. Le devenir de chaque sous-population de cellules T mémoires sera suivi dans ces deux systèmes en fonction de la spécificité, la fonction (Th1 vs Th2 pour les cellules CD4) et l'âge des cellules mémoires. Ces études devraient contribuer à la compréhension des règles qui gouvernent la génération et la maintenance du pool des cellules T CD4 et CD8 mémoires au cours de stimulations antigéniques aiguës (i.e. vaccination) ou chroniques (i.e. infection par le VIH).

Survie des cellules T CD8 (Nicolas Legrand, Yi Hao). Pour tester le rôle des molécules de classe I du CMH dans la survie et la prolifération induite par lymphopénie des cellules T CD8+, nous avons développé un nouveau système de transfert adoptif de lymphocytes T dans des hôtes contenant différents patterns d'expression des molécules de classe I du CMH. Les cellules T de donneur, isolées à partir de souches de souris transgéniques pour un TCR dans un fond déficient Rag (souris MoaHY, MoP14 et MoOT-1), ont été transférées séparément dans différents types d'hôtes : souris de classe I+ déficientes en cellules T (CD3ε-/-), ou déficientes pour l'expression des molécules de classe I du CMH (CD3ε-/-xH-2Db-/- ; CD3ε-/-xH-2Kb-/- et CD3ε-/-x2m-/-xH-2Db-/-xH-2Kb-/-). Après transfert dans des hôtes classe I+, les cellules T se maintiennent sans division (MoaHY) ou présentent une forte prolifération (MoP14, MoOT-1), selon une hiérarchie de promiscuité du TCR (MoOT-1>MoP14>MoaHY). Après transfert dans des souris H-2Db déficientes, les cellules T MoaHY et MoP14, toutes deux H-2Db restreintes, disparaissent en moins de 2 jours. A l'opposé, les cellules T CD8 exprimant le TCR OT-1 (H-2Kb restreintes) transférées dans des souris H-2Kb déficientes survivent en quantité. L'utilisation de souris "TetraKO" devrait nous permettre de préciser le rôle controversé des molécules de classe I du CMH dans la survie des cellules T CD8+ mémoire.

La signalisation Notch dans le développement et la survie lymphocytaire (Alix de la Coste). Lors du développement lymphoïde, il a été montré que la signalisation via Notch influence l'engagement des cellules B versus T. Le rôle critique de l'activation Notch dans le choix de la lignée T a été bien établi. Toutefois, l'identité du ligand Notch qui déclenche ce signal critique n'est pas encore connue. Pour tester l'activité du ligand Delta-1 de Notch, in vivo, nous avons reconstitué le système immunitaire de souris létalement irradiées avec des cellules souches hématopoïétiques issues de foies foetaux (e14,5) transduites avec un rétrovirus exprimant Delta-1. Nous avons observé que Delta-1 induit le développement ectopique des cellules T CD4+CD8+ double positives immatures dans la moelle osseuse, la rate et les ganglions lymphatiques de souris C57BL/6 sans provoquer de désordre lymphoprolifératif. Le développement T ectopique dans la moelle osseuse est associé à l'inhibition concomitante du développement B. De plus, nous avons montré que chez la souris athymique nu/nu, l'expression du ligand Delta-1 induit les signaux appropriés à une maturation T totale. Ainsi, nos résultats montrent qu'in vivo en absence de thymus l'expression de Delta-1 dans la moelle osseuse est suffisante pour "récapituler" le développement T depuis les stades les plus immatures.

Mots-clés: cellules B, cellule T, homéostasie lymphocytaire, survie lymphocytaire, mémoire immunologique


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