Unité: Défense innée et Inflammation - Inserm E336

Responsable: Chignard Michel

Nos travaux concernent la défense innée et l'inflammation au niveau pulmonaire et utilisent diverses approches in vitro ainsi que des modèles animaux. Nous étudions dans un contexte physiopathologique, le rôle des cellules épithéliales, des macrophages alvéolaires, des neutrophiles et certains de leurs récepteurs : "Toll-like receptors" (TLR), "proteinase-activated receptors" (PAR), et CD87. Un autre aspect de nos recherches concerne la synthèse et les effets, en particulier les interactions avec le surfactant, des phospholipases A2 (PLA2) sécrétées par les macrophages alvéolaires (voir figure).

Les poumons sont le siège de différentes pathologies dans lesquelles les mécanismes de défense innée et d'inflammation interviennent de façon essentielle. Parmi celles-ci figurent des pathologies majeures telles que le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO), la mucoviscidose, ou encore les pneumopathies infectieuses telle que l'aspergillose pulmonaire invasive. Le processus de défense innée est naturellement bénéfique, mais son exacerbation peut conduire à des états inflammatoires préjudiciables. C'est dans ce contexte que nos travaux se proposent d'apporter une meilleure connaissance qualitative et quantitative des mécanismes impliqués, et qui pourrait permettre de cibler les évènements favorisant la défense innée sans augmenter la composante inflammatoire.

Interactions cellulaires dans l'environnement aérien pulmonaire (Michel Chignard, Dominique Pidard et Mustapha Si-Tahar)

Au cours du cycle respiratoire, les espaces aériens sont exposés à une multitude de particules et de micro-organismes. Les cellules du système immunitaire identifient les éléments infectieux au moyen notamment des TLR. Le rôle de ces récepteurs dans la reconnaissance des pathogènes et de leurs produits (LPS, lipoprotéines,…) par les cellules épithéliales pulmonaires n'est pas clairement établi. Or, ces cellules constituent une ligne de défense majeure contre les pathogènes. Nous avons montré par RT-PCR et immuno-empreinte que TLR4 est constitutivement exprimé dans plusieurs lignées épithéliales pulmonaires humaines (alvéolaire : A549 ; trachéo-bronchiques : BEAS-2B, 16-HBE, NT-1 et CFT-2, cette dernière lignée présentant un phénotype mucoviscidosique). La localisation intracellulaire du TLR4 a été démontrée par cytométrie en flux et microscopie confocale dans les cellules A549 et BEAS-2B et dans des cellules bronchiques primaires isolées de poumon humain. Par ailleurs, au contact de LPS isolé de Pseudomonas aeruginosa, ces cellules produisent des médiateurs inflammatoires comme l'interleukine (IL)-8 et l'IL-6. Le rôle des voies de signalisation cellulaire dépendant du TLR4 dans cette activation épithéliale a été démontré par l'utilisation de vecteurs plasmidiques exprimant les formes dominantes négatives de MyD88 et de TRAF6, deux molécules adaptatrices impliquées dans la cascade transductionelle associée au TLR4 et conduisant à l'activation de NF-κB. De plus, nous avons établi que l'activation cellulaire induite par le LPS implique également des MAPkinases. Ces résultats démontrent que TLR4 exprimé par les cellules épithéliales pulmonaires constitue un élément clef dans la réponse de l'hôte vis-à-vis des bactéries à Gram négatif et leurs dérivés.

Les macrophages et les polynucléaires neutrophiles jouent également un rôle important dans les pathologies pulmonaires inflammatoires et infectieuses. Dans le cas des neutrophiles, leurs effets s'exercent en particulier au travers de la libération de trois sérine protéinases, l'élastase, la cathepsine G et la protéinase 3. Nous nous sommes attachés à analyser l'activité de ces protéinases sur divers récepteurs membranaires impliqués dans les processus de défense innée et d'inflammation. Nos travaux montrent un effet de l'élastase et de la cathepsine G sur les leucocytes eux-mêmes, au travers d'une diminution de l'expression membranaire de CD87/uPAR ("urokinase-type plasminogen activator receptor"), une glycoprotéine également exprimée par les cellules épithéliales, et impliquée dans les mécanismes d'adhérence et de migration cellulaires et dans la réparation tissulaire. Des expériences ont montré que ces mêmes protéinases clivent et désactivent le PAR-2 exprimé par les cellules épithéliales pulmonaires. Ce récepteur dont on ne connaît pas le (ou les) activateur(s) physio(patho)logique(s), est également impliqué dans les mécanismes de défense innée et d'inflammation. Pour ces deux récepteurs, des approches de protéomique ont permis de déterminer précisément les sites de clivage (collaboration avec les plate-formes d'Analyse et de Microséquençage des Protéines, et de Protéomique). Nos travaux actuels envisagent également l'activité de protéinases bactériennes sur ces deux récepteurs, en particulier de l'élastase libérée par P. aeruginosa, l'une des principales bactéries opportunistes responsables d'infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose.

Un modèle expérimental d'étude de la réponse innée pulmonaire a par ailleurs été mis au point chez la souris infectée par Aspergillus fumigatus. Ce champignon est responsable de l'aspergillose pulmonaire invasive (API) chez les patients immunodéprimés. Notre approche est centrée sur l'analyse, au cours de la progression de l'API, de différents paramètres caractéristiques de la réponse inné, et en fonction de deux types d'immunosuppression: soit par corticothérapie, soit par chimiothérapie neutropéniante. A différents temps après l'induction de l'infection, les réponses de l'hôte ont été comparées en termes de survie, de production pulmonaire de cytokines pro- et anti-inflammatoires, d'afflux de cellules dans les espaces aériens, de lésions pulmonaires, de détresse respiratoire et de développement fongique. Nous avons observé qu'en fonction du type d'immunosuppression, la pathogénèse de l'API impliquait plus spécifiquement un rôle prédominant soit du développement fongique, soit de la réponse exacerbée et néfaste de l'hôte. Nous avons également montré que TLR2 jouait un rôle important dans la réponse immune vis-à-vis d'A. fumigatus. Ainsi, les macrophages alvéolaires des souris déficientes pour ce récepteur, produisent moins de cytokines et de chimiokines que ceux des animaux sauvages en réponse au champignon. Nous avons également mis en évidence qu'au cours de l'infection in vivo, la détresse respiratoire ainsi que la charge en pathogènes sont plus importantes chez les souris déficientes, et que leur survie est diminuée (collaboration avec l'unité des Aspergillus et celle d'Histotechnologie et Pathologie).

Mécanismes de régulation et rôles des phospholipases A2 dans les pathologies inflammatoires pulmonaires (Carine Mounier, Lhousseine Touqui)

Les PLA2 hydrolysent les phospholipides membranaires en position sn-2, conduisant à la production de lyso-phospholipides et d'acides gras libres, en particulier d'acide arachidonique. Ce dernier est le précurseur des leucotriènes et des prostaglandines, doués d'activités biologiques diverses et impliqués dans différentes pathologies inflammatoires, en particulier dans le SDRA.En outre, l'hydrolyse des phospholipides des membranes cellulaires par les PLA2 provoque une réorganisation de la fluidité et de la composition lipidiques de ces membranes, conduisant à une modification de leurs propriétés physico-chimiques. Plusieurs types de PLA2 ont été décrits chez les mammifères et ont été classées en deux familles : les PLA2 intracellulaires et les PLA2 sécrétées (sPLA2). La sPLA2 de type IIA (sPLA2-IIA) joue un rôle important dans des maladies inflammatoires comme l'arthrite rhumatoïde, le choc septique, les rhinites allergiques, ou le SDRA. Nous avons mis au point un modèle animal qui reproduit les critères anatomo-pathologiques du SDRA. Ce modèle est basé sur l'administration de LPS par voie intratrachéale chez le cobaye. Nous avons montré que le LPS provoque une inflammation pulmonaire aiguë accompagnée d'une expression accrue de la sPLA2-IIA et de sa libération dans l'espace alvéolaire. Des résultats similaires ont été observés dans un modèle de SDRA induit par instillation de P. aeruginosa chez le rat. Les macrophages alvéolaires sont la principale source de cette enzyme dont l'expression est induite par un processus autocrine/paracrine impliquant le TNF-α et une translocation nucléaire de NF-κB. Nous avons montré que la sPLA2-IIA intervient dans l'hydrolyse des phospholipides du surfactant pulmonaire et avons suggéré que ce processus pourrait être impliqué dans l'altération de ce dernier. Cette altération est une des caractéristiques du SDRA, conduisant à l'apposition permanente des parois alvéolaires, entravant ainsi la diffusion de l'oxygène. Nous avons également montré que l'hydrolyse du surfactant est régulée par la protéine A du surfactant (SP-A) qui inhibe l'activité de la sPLA2-IIA par une interaction spécifique et dépendante du calcium. L'hydrolyse du surfactant par la sPLA2-IIA est ainsi plus marquée in vitro et in vivo chez des souris SP-A-/- que chez des souris sauvages. La SP-A inhibe également l'activité des sPLA2-V et -X, mais pas celle des sPLA2-IB, -IID et -IIE. Cette propriété de la SP-A pourrait être considérée comme un mécanisme de défense permettant de protéger le surfactant contre l'action délétère des sPLA2. Enfin, des travaux en cours montrent que la sPLA2-IIA synthétisée par les macrophages alvéolaires de cobaye, ou présente dans les espaces aériens de patients souffrant de SDRA, est douée de propriétés bactéricides, en particulier vis-à-vis de bactéries à Gram positif. Ces résultats suggèrent que la sPLA2-IIA joue non seulement un rôle pro-inflammatoire mais peut également être impliquée dans la défense anti-bactérienne pulmonaire. Par ailleurs, nous avons étudié les répercussions de la délétion du gène CFTR sur l'expression pulmonaire de la sPLA2-IIA et sa signification physiopathologique dans la mucoviscidose. Les résultats ont montré que la délétion du gène CFTR engendre une libération accrue de prostaglandine E2 (PGE2) dans les espaces aériens de souris CFTR-/- traitées au LPS. Cette différence a été observée in vitro dans des cellules épithéliales bronchiques humaines portant la mutation ?F508 du canal CFTR stimulées par le LPS. Elle est accompagnée d'une augmentation de l'expression de la sPLA2-IIA et d'une sur-activation de NF-κB. Ces effets sont également observés avec les cellules stimulées par la PGE2. Ces résultats suggèrent que la mutation ?F508 du canal CFTR exerce une influence sur le niveau d'expression de la sPLA2-IIA par l'intermédiaire de la PGE2 dans les cellules épithéliales pulmonaires et que NF-κB peut jouer un rôle dans ce processus.

Mots-clés: innée/inflammation, cellules épithéliales, neutrophiles, macrophages, Toll-like receptors, protéinases, phospholipases A2, surfactant, pneumopathies


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