Unité: Cryomicroscopie moléculaire

Responsable: Gérard Pehau-Arnaudet

Crée en Avril 2002, la Plate-forme de cryomicrocopie moléculaire a pour vocation de mettre à disposition du campus Pasteurien un outil moderne de la biologie structurale, la microscopie électronique et la cryomicroscopie electronique. Complétant d'autres approches (Rayons X, RMN), la cryomicroscopie repose sur l'observation d'objets biologiques hydratés et congelés. Couplée à des techniques d'analyses d'images, elle permet d'obtenir des informations structurales à moyenne résolution (généralement entre 7 et 30 Å). Nous sommes actuellement engagés sur trois thématiques: l'analyse d'une couche S de Bacillus anthracis par cristallographie électronique (collaboration avec l'équipe de M. Mock), l'étude de la structure du super complexe RC-LH1 de Rubrivivax gelatinosus et enfin l'étude tri-dimensionnelle des particules sous-virales HBs.

L'implantation en Décembre 2001 d'un cryomicroscope à émission de champ (Jeol 2010F), nous conduit à accueillir des équipes extérieures au campus désireuses de mener des études structurales à haute/moyenne résolution.

A côté de ces activités de recherche et de service, la Plate-forme est impliquée dans des actions d'enseignement.

Crée en Avril 2002, la plate-forme de cryomicroscopie moléculaire a pour vocation de mettre en œuvre les techniques de la microscopie électronique dans le champ de la biologie structurale, en complément des approches classiques (RMN, Rayons X) déjà présentes sur le campus Pasteurien. Depuis le début des années quatre-vingt, la cryomicroscopie s'est imposée comme une technique de choix en biologie structurale. Cette méthodologie repose sur la congélation d'objets biologiques dans leur état hydraté, à une vitesse empêchant toute formation de glace cubique ou hexagonale. Les échantillons sont inclus dans un film de glace vitreuse, observés à une température voisine de -180°C sous de très faibles doses d'électrons (<10 électrons/Å2). Les données structurales sont ensuite extraites, en utilisant différents programmes informatiques. Une des caractéristique de la cryo-microscopie est qu'elle s'intéresse à de nombreux objets biologiques: les protéines (PM ? 300 kDa), les cristaux bidimensionnels de protéines (PM ? 30 kDa), les virus, l'ADN, l'ARN …

1-Etude par Cristallographie Electronique d'une des Couche S de Bacillus anthracis : Xavier Hagnerelle, Gérard Pehau Arnaudet, Agnès Fouet et Pedro Alzari

Les couches S sont des composants de la surface de l'enveloppe cellulaire de certains organismes procaryotes, formant des réseaux cristallins bidimensionnels de nature protéique . Chez Bacillus anthracis, la couche S est constituée de deux protéines de 94 kDa : Sap (Surface array protein) et EA1 (Extractable Antigen 1), formant chacune un réseau cristallin différent à la surface de la bactérie.

Au laboratoire, nous étudions l'organisation de la protéine Sap au sein de sa couche S. Pour cela nous avons mis en place la méthode de cristallisation bidimensionnelle sur film lipidique et nous l'avons adapté à l'étude d'une protéine Sap délétée de son domaine d'ancrage à la bactérie et substitué par un motif de six histidines : cette approche nous a permis de reconstituer in vitro un réseau cristallin identique à celui observé à la surface de B. anthracis. Ces cristaux bidimensionnels ont ensuite été utilisés pour une étude par cryo-microscopie ; après traitement des enregistrements, une carte de projection du réseau à 12 Å de résolution a été calculée, ce qui permet de définir l'enveloppe de la protéine, son organisation spatiale au sein de la maille cristalline, et, met en lumière les contacts cristallins entre les sous-unités protéiques.

En parallèle, nous effectuons des expériences de cristallisation tridimensionnelle pour des études radiocristallographiques, en vue d'obtenir la structure atomique de la protéine Sap et de compléter la carte de projection obtenue en restituant au polypeptide son enveloppe bidimensionnelle native au sein de la couche S.

Réseau reconstitué in vitro de la protéine Sap modifiée.

A gauche : image filtrée du cristal bidimensionnel de la protéine Sap modifié obtenu par cryo-microscopie (taille : environ 220 nm x 220 nm).

A droite : carte de projection du réseau de la protéine Sap calculée à 12 Å de résolution. La maille cristalline est représentée en rouge ; elle contient 2 protéines reliées entre elles par l'axe de symétrie 2. Chaque protéine possède 4 sous domaines notés de 1 à 4. Paramètres de maille : a = 207,5 ± 1,4 Å, b = 87,8 ± 1,4 Å, γ = 96,5 ± 0,20΅.

2-Comprendre le mécanisme de transfert d'une quinone de son site de réduction vers son site d'oxydation par analyse structurale au moyen de la microscopie électronique : J-L Ranck (CR1, CNRS, UMR168, Institut Curie, Paris), F. Reiss-Husson (DRCE, CNRS, CGM-UPR6067, Gif sur Yvette)G. Pehau-Arnaudet

Les bactéries photosynthétiques convertissent l'énergie lumineuse (système collecteur de lumière LH1, LH2) en énergie chimique (centre réactionnel RC). Au cours de cette conversion, il y a production d'une quinone réduite au niveau du RC. Cette quinone est transférée vers son site d'oxydation sur le cytochrome bc1. Ce transfert s'effectue par diffusion au sein de la membrane plasmique à travers le super complexe RC-LH1. L'étude d'une bactérie formant in vivo des cristaux bidimensionnels de ce super complexe (Rhodobacter sphaeroides) nous a permis de comprendre ce transfert par la mise en évidence d'une ouverture dans l'anneau entourant le centre réactionnel RC. Pour savoir si cette structure ouverte est généralisable, nous avons entrepris d'isoler et de caractériser, à partir d'une autre espèce Rubrivivax gelatinosus, les super complexes RC-LH1. Nous avons reconstitué, in vitro, des cristaux bidimensionnels, à partir de ces super complexes purifiés, afin de les étudier par différentes approches de microscopie électronique. Nous nous concentrons sur la structure de l'anneau de LH1 entourant le centre réactionnel en analysant les cristaux 2D et les super complexes en solution. Les premières projections moyennées de super complexes dans les deux types d'échantillons montrent une possible interruption de l'anneau LH1. Nous nous proposons d'affiner ces données en alignant et moyennant un très grand nombre d'images de super complexes.

3-Etude tri-dimensionnelle des particules sous-virales HBs : I. Komla-Souka (Doctorante, INTS, Paris), G. Pehau-Arnaudet, C. Sureau (CR1, CNRS, INTS, Paris)

Bien que le virus de l'hépatite B (HBV) ait fait l'objet d'études approfondies depuis plus de 25 ans, nous ne disposons d'aucune information précise sur la structure tridimensionnelle des protéines d'enveloppe des virions ou des particules sous-virales (appelées aussi particules HBs). Notre compréhension des mécanismes d'assemblage et d'infectiosité du HBV reste donc limitée, rendant difficile le développement de molécules neutralisantes ciblant des éléments structuraux à la surface du HBV. Notre projet à pour but d'établir une représentation en 3 dimensions des particules HBs qui sont naturellement produites en quantités énormes au cours d'une infection, et qui constituent le vaccin anti-HBV actuellement disponible. Elles sont composées d'une seule glycoprotéine HBV (la protéine S), et leur enveloppe est de composition identique à celle des virions matures. Pour les besoins de cette étude, elles sont produites et purifiées au laboratoire de virologie de l'INTS-Paris, puis elles sont examinées en microscopie électronique soit après coloration négative, soit en cryomicroscopie. Les reconstructions 3D des particules HBs devraient conduire à l'élaboration de stratégies antivirales innovantes grâce, notamment, à une meilleure compréhension des phénomènes d'interaction entre les protéines d'enveloppes HBV et les protéines de surface de l'hépatocyte ou les anticorps neutralisant.

5-Activité de service

En Décembre 2001, grâce à un cofinancement Institut Pasteur, CNRS, Région Ile de France, était implanté au sein de la plate-forme de un microscope électronique Jeol de 200kV à canon à émission de champ, totalement équipé et dédié à la cryomicroscopie à haute résolution. L'implantation de ce cryomicroscope est née de la volonté d'un certain nombre de laboratoires français issus du GDR 2368 de se doter d'un équipement de pointe.

L'année 2002, a permis l'optimisation de cet instrument qui, à l'automne 2002, a été ouvert à l'ensemble de la communauté des laboratoires regroupés dans ce projet fédératif et plus généralement à l'ensemble de la communauté des cryomicroscopistes français.

Au cours de l'année 2003, l'inauguration officielle du cryomicroscope a donné lieu à une cérémonie le 06 Février 2003 http://www.cnrs.fr/CMA/dyna/article.php3?id_article=244.

Un comité de programme Institut Pasteur/CNRS présidé par F. Livolant, réuni par deux fois au cours de l'année 2003, est chargé d'arbitrer les demandes d'accès à ce microscope. Après l'aval de ce comité de programme, nous avons été conduits à accueillir deux chercheurs :

a- Venant du LMCP (laboratoire de minéralogie-cristallographie de Paris, CNRS, UMR7590, Paris 6 et Paris 7), le docteur Nicolas Boisset (DR2, CNRS) (http://www.lmcp.jussieu.fr/%7Enboisset/ )

b- Venant de Rennes, UMR 6026, le docteur Patrick Bron (MC, UMR 6026, Université de Rennes) ( http://www.crm.univ-rennes1.fr/)

6- Activité d'enseignement

Enfin au cours de l'année 2003 nous avons été amené à participer à deux actions de formation : l'une au sein du cours de formation continue de microscopie électronique organisé par la Plate-forme de microscopie électronique , l'autre au sein du cours de Biochimie des Protéines de l'Institut Pasteur dans le cadre du DEA "  Structure, Fonction et Ingénierie des Protéines ", Université Paris 6, Paris 7 et Paris 11, Ecoles Doctorales " Biochimie et Biologie Moléculaire "  (B2M), " Interbio " et "  Innovations thérapeutiques "

Mots-clés: cryomicroscopie, microscopie électronique, biologie structurale, protéine Sap, super complexe RC-LH1, HBs


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