Unité: Chimie Organique

Responsable: Bost Pierre-Etienne

Les travaux de l'Unité de Chimie Organique concernent la synthèse et l'étude de molécules biologiquement actives. L'accès à ces molécules originales permet d'étudier leurs structures et, en collaboration avec d'autres unités pasteuriennes de préciser leurs interactions biologiques. Avec l'objectif de mettre en évidence de nouvelles approches thérapeutiques, des vaccins synthétiques, des inhibiteurs d'enzymes ou des produits actifs sur des cibles biologiques potentielles sont préparés. Par ailleurs, deux groupes de l'Unité ont développé un programme de sélection in vivo et d'évolution dirigée in vitro d'enzymes.

Nucléoside monophosphate kinases de Mycobacterium tuberculosis

(Laurence Dugué, Cécile Gasse, Sylvie Pochet et Hélène Munier-Lehmann)

Les nucléoside monophosphate kinases (NMPKs) de M. tuberculosis, bactérie responsable de la tuberculose, constituent des cibles potentielles en thérapie antituberculeuse. Une approche par conception d'inhibiteurs à partir de la structure tridimensionnelle a été retenue (en collaboration avec G. Labesse et D. Douguet). Deux NMPKs, la TMPK et l'UMPK, ont été plus particulièrement étudiées dans le cadre d'un Programme Transversal de Recherche regroupant plusieurs équipes de l'Institut Pasteur. Cette année, la recherche d'inhibiteurs de la TMPK a été poursuivie. A partir des molécules non nucléosidiques précédemment sélectionnées par optimisation rationnelle du substrat naturel et par criblage in silico de banques de molécules, des composés structuralement proches ont été synthétisés (en collaboration avec P. Herdewijn et S. Van Calenbergh). Ceux présentant des affinités micromolaires ont été testés sur des cultures de M. tuberculosis mais n'ont pas induit d'inhibition de croissance. Pour affiner la conception de produits de plus forte affinité, certains dérivés font l'objet d'essais de co-cristallisation.

Evolution dirigée d'enzymes par sélection

(Sophie Vichier-Guerre, Pierre-Alexandre Kaminski et Jean-Luc Jestin)

Pour concevoir des catalyseurs sur mesure, l'évolution dirigée d'enzymes apparaît comme une approche prometteuse. Alors que les stratégies classiques d'évolution dirigée d'enzymes font appel au criblage, nous développons des méthodes de sélection qui permettent d'analyser simultanément l'activité catalytique de plus de 108 protéines distinctes. Les sélections en fonction de l'activité catalytique sont réalisées in vivo en utilisant des souches appropriées de bactéries Escherichia coli et in vitro en utilisant une chimie des Inovirus. En 2003, des ADN-polymérases thermostables dotées d'activités catalytiques nouvelles ont été obtenues par sélection in vitro et des variants de N-désoxyribosyltransférases acceptant des analogues de nucléosides ont été isolés par sélection in vivo. Les applications thérapeutiques des stratégies d'évolution dirigée d'enzymes définissent les projets en cours.

Apoptose et nouvelles approches thérapeutiques liées aux Protéine Phosphatases PP1/PP2A

(Alphonse Garcia, Julien Guergnon,Véronique Hospital, Frédéric Dessauge et Victoria Dominguez)

In vivo les protéines phosphatases de type 1 (PP1) et 2A (PP2A) contrôlent 90% de la déphosphorylation des protéines sur les résidus ser/thr. PP1 et PP2A forment une famille de plusieurs holoenzymes d'expression ubiquiste qui sont produites par l'interaction spécifique entre des sous-unités (PP1c) ou des unités catalytiques AC (formés de l'association des isoformes de PP2Ac avec des isoformes des protéines structurales A/PR65) et une grande variété de sous-unités régulatrices qui sont impliquées dans le ciblage et/ou la régulation de l'activité enzymatique. La recherche actuelle du groupe phosphatase a conduit à proposer une nouvelle approche thérapeutique (concept DPT) basée sur l'inhibition de processus pathologiques par transfert intracellulaire de peptides mimant des sites d'interaction avec des protéines de la famille des protéines PP1 et PP2A. Cette approche est fondée sur les deux résultats suivants :

a- l'identification de biopeptides pénétrants dont les séquences présentent des sites d'interaction avec la phosphatase PP2A .

b- l'identification de deux motifs consensus [RK]-x-(0,1)-V-x-F et F-x-x-[RK]-x-[RK] impliqués dans l'interaction des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, avec la sous-unité catalytique de PP1. La présence simultanée de ces deux motifs dans les sous-unités régulatrices connues de PP1 a permis de proposer le concept de signature. Pour développer ce concept, nous avons créé le site web: http://pp1signature.pasteur.fr . Cet outil bioinformatique permet d'identifier, à partir des séquences protéiques présentes dans la banque Swissprot, des protéines potentiellement capables d'interagir avec PP1c. Nous avons ainsi sélectionné et caractérisé par co-immunoprécipitation plusieurs nouvelles protéines qui interagissent avec PP1c.

PP2A est une cible anti-tumorale potentielle : l'interaction de la protéine adénovirale E4orf4 avec la sous-unité B de PP2A induit spécifiquement la mort des cellules tumorales via un mécanisme indépendant de la p53. L'identification et la caractérisation (comparaison cellules normales et cellules tumorales ex vivo, étude chez la souris) de peptides pénétrants mimant des sites d'interaction de diverses protéines avec la sous-unité B de PP2A permettrait de reproduire l'effet apoptotique induit par la protéine adénovirale. Dans le cadre du PTR-136 coordonné par Alphonse Garcia en collaboration avec les groupes de M.-A. Buendia, C. Rougeot et M. Huerre, nous rechercherons des peptides pénétrants capables de mimer in vitro le signal anti-tumoral induit par l'interaction E4orf4 Ba. Ces peptides devraient provoquer ex vivo (cellules transformées) et in vivo, l'apoptose des tumeurs (chez la souris dans un modèle d'hépatocarcinome lié à c-myc). Des études structurales (biacore et co-crystallographie de PP1c avec des peptides dont les séquences correspondent aux sites d'interaction de protéines régulant l'apoptose) devraient permettre de préciser les mécanismes de régulation de la phosphatase et son rôle dans le contrôle de l'apoptose. L'identification de biopeptides pénétrants et la synthèse de peptidomimétiques interagissant avec PP2A pourraient déboucher sur une nouvelle thérapie anti-tumorale.

Glycopeptides synthétiques à potentiel vaccinal anti-tumoral

(Sylvie Bay, Christelle Ganneau et Teresa Freire)

S'appuyant sur une approche rationnelle et spécifique de l'immunothérapie anti-tumorale, notre programme de recherche vise à développer des vaccins synthétiques basés sur des marqueurs tumoraux saccharidique. Nous avons ainsi mis au point un nouveau type d'immunogène : le MAG ou Multiple Antigenic Glycopeptide qui présente l'épitope saccaridique d'intérêt (i.e. le marqueur tumoral) de façon multivalente en association avec un épitope T CD4+ peptidique. Le caractère synthétique des MAG constitue un avantage de sécurité essentiel en vue de leur utilisation in vivo.

L'ensemble de nos résultats (collaboration avec R. Lo-Man et C. Leclerc, Institut Pasteur) montre que le MAG est une stratégie efficace pour générer des taux élevés d'anticorps spécifiques du marqueur saccharidique et pour prolonger la survie de souris porteuses de tumeur, après vaccination thérapeutique ou prophylactique.

Nous avons également préparé une nouvelle génération de composés potentiellement utilisables chez l'homme, en introduisant des épitopes T CD4+ "universels" au sein des structures. Les premiers composés sont très immunogènes chez le singe ainsi que chez des souris transgéniques pour les molécules HLA.

Une autre partie de notre programme consiste à synthétiser des glycopeptides pour induire des réponses T cytotoxiques spécifiques.

Glycoconjugués porteurs de phosphorylcholine pour le développement de thérapies anti-bactériennes

(Sylvie Bay)

L'objectif est de développer une nouvelle approche thérapeutique, basée sur l'utilisation d'anticorps, pour combattre certaines infections bactériennes du tractus respiratoire (Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis). Dans ce but, nous avons synthétisé un mime d'un antigène naturel ubiquitaire exprimé à la surface des bactéries, la phosphorylcholine glycosylée, synthon à partir duquel nous avons préparé des conjugués protéiques ainsi qu'un dérivé biotinylé. Ces réactifs seront utilisés pour générer des anticorps à visées thérapeutique et/ou diagnostique.

Synthèse et réactivité biologique de nucléosides hétérodoxes

(Claudio Cadena, Laurence Dugué et Sylvie Pochet)

L' objectif est d'élargir la gamme des acides nucléiques qui peuvent être répliqués in vitro ou in vivo. Parmi les altérations structurales de l'ADN précédemment abordées, nous avons exploité celle affectant la partie hétérocyclique du nucléoside. L'influence des modifications sur la reconnaissance de ces molécules par les enzymes de la biosynthèse des acides nucléiques est ensuite examinée in vitro. Plusieurs bases nucléiques découlant des bases puriques oxidées de l'ADN ont été synthétisées, ainsi que des oligonucléotides les contenant. De tels motifs sont intrinsèquement capables de former des liaisons hydrogène avec les bases canoniques, ainsi qu'avec eux-mêmes. L'étude de la reconnaissance de ces nucléosides par les enzymes de l'ADN et plus particulièrement les polymérases, est en cours. Par ailleurs, ces analogues ont permis de préciser le mécanisme de reconnaissance de l'enzyme humaine MTH1 impliquée dans la réparation de l'ADN par hydrolyse des désoxynucléotides oxydés (Coll. H. Kamiya, Japon).

Polysaccharides bactériens et développement de vaccins glycoconjugués chimiquement définis (PTR 99)

(Catherine Guerreiro, Cyrille Grandjean et Laurence Mulard)

Le rôle clé des polysaccharides de surface bactérienne comme cibles majeures de la réponse immunitaire protectrice de l'hôte en réponse à une infection est maintenant bien établi. Dans le but de développer un vaccin de type conjugué polysaccharide-protéine contre les infections à Vibrio cholerae serotype O1, plusieurs conjugués impliquant le lipopolysaccharide détoxifié d'une souche Inaba ont été préparés. L'évaluation de leur immunogénicité chez la souris est en cours (coll. J.-M. Fournier, Unité du Choléra et des Vibrions, Institut Pasteur).

Fondé sur la notion d'épitopes osidiques "protecteurs" et dérivé du concept de l'haptène, le développement d'immunogènes synthétiques offre une alternative aux vaccins conjugués polysaccharide-protéine conventionnels. Inscrit dans cette thématique, notre objectif principal est de développer des constructions chimiquement définies, présentant de façon multivalente une combinaison d'épitopes osidiques reconnus par des anticorps protecteurs (épitopes B) et d'épitopes T appropriés à l'induction d'une réponse mémoire. Shigella flexneri, responsable d'une forme sévère de dysenterie, est utilisée comme modèle pour démontrer le potentiel de l'approche glycoconjugués synthétiques dans le domaine des vaccins multivalents.

L'approche rationnelle mise en place nous a permis de caractériser un épitope immunodominant porté par l'antigène O et reconnu par des anticorps monoclonaux protecteurs contre l'infection par S. flexneri 2a. Des glycoconjugués chimiquement définis composés de haptènes osidiques de différentes longueurs, représentatifs de cet épitope, couplés par liaison covalente à un peptide T helper ou à une protéine porteuse ont été synthétisés selon une approche modulaire. Plusieurs des glycoconjugués évalués induisent chez la souris des taux en anticorps anti-lipopolysaccharide (LPS) comparables ou supérieurs à ceux d'un conjugué LPS détoxifié-protéine porteuse de référence. L'évaluation de la protection induite par ces glycoconjugués chimiquement définis est en cours (coll. A. Phalipon, Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur).

Synthèse peptidique

(Françoise Baleux)

Notre groupe peptide s'est spécialisé dans la synthèse et la purification de longs peptides (50-70 AAs) et de peptides modifiés.

Peptides anti-inflammatoires issus de NEMO

En réponse à des stimuli très divers tels que les cytokines (TNF-a, l'IL-1) ou les endotoxines (LPS), la cellule active une série de gènes impliqués dans les réponses inflammatoires et immunitaires, l'oncogénèse et l'apoptose, gènes sous le contrôle de la voie de signalisation NF-kB. La protéine NEMO (NF-kB essential Modulator) joue un rôle essentiel dans l'activation de kinases IKK impliquées dans cette voie de signalisation. En collaboration avec F. Agou et M. Véron (Unité de régulation enzymatique des activités cellulaires), nous avons montré que des peptides issus du domaine d'oligomérisation de NEMO étaient capables d'inhiber l'effet du LPS et ce à des concentrations micromolaires, ces peptides étant dépourvus d'effet cytoxique. Ces peptides ouvrent la voie vers de nouveaux composés anti-inflammatoires ou anti-tumoraux.

Chimiokines/HIV

Les chimiokines SDF-1a et Mip1-b/RANTES inhibent l'entrée du virus HIV dans les cellules CD4+ via les co-récepteurs CXCR4 et CCR5. Ces mini-protéines de 70 acides aminés sont accessibles à la synthèse chimique. L'intérêt de la synthèse chimique est qu'elle permet l'introduction d'acides aminés non naturels, l'incorporation sélective de marqueurs et des modifications de la liaison peptidique. Nous avons ainsi pu générer des mutants qui résistent à la dégradation par l'Elastase, une des enzymes impliquées dans la régulation de l'activité de la chimiokine SDF.

Mots-clés: vaccins synthétiques, chimiokines, nucléosides hétérodoxes, sélection in vivo d'enzymes, évolution in vitro


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