Unité: Biologie Moléculaire du Gène

Responsable: Philippe KOURILSKY - Marie-Lise GOUGEON

L'unité a poursuivi des études sur la diversité des répertoires des lymphocytes T et B et sur les fonctions de diverses sous-populations lymphocytaires dans des situations physiologiques et pathologiques.

1- Etude des sous-populations de lymphocytes T de mémoire " centrale " et " effectrice " chez la souris et chez l'Homme (Cecile Bouneaud et Christophe Pannetier)

Bien qu'il soit généralement accepté qu'on puisse subdiviser la population T mémoire en deux compartiments appelés mémoire " centrale " (TCM) et " effectrice " (TEM), les voies de différenciation de ces deux sous-populations sont encore mal connues, de même que leurs relations de filiation éventuelles. Une première étude, réalisée chez l'Homme sur la population T CD8 mémoire, nous a permis de montrer que les sous-populations TCM et TEM totales avaient des répertoires des TCR très différents. Cependant, nous aurions souhaité étudier des sous-populations spécifiques d'un antigène particulier et à partir de différents organes. D'autre part, différentes études suggèrent que leurs efficacités relatives de réponse secondaire seraient inégales.

Nous avons donc mis en place un modèle murin nous permettant d'étudier les cellules CD8 TCM et TEM spécifiques du peptide mâle Smcy3 présenté par H2-D: des cellules T CD8 naïves transgéniques pour la chaîne β du TCR H-Y sont transférées dans une femelle C57BL/6 qui est ensuite immunisée par voie intraveineuse avec de la moelle osseuse d'un mâle syngénique. Grâce à ce modèle, nous avons pu étudier le répertoire TCRα des deux sous-populations mémoire soit à un temps donné dans différents organes lymphoïdes et périphériques, soit à deux temps dans la rate avec ou sans restimulation entre ces deux temps. Nos résultats montrent que 1) à un temps donné, les répertoires des deux sous-populations sont distincts et il y a une bonne recirculation des clones dans l'organisme, 2) en cas de restimulation, une fraction des clones TCM donne naissance à des clones TEM, tandis que la majorité des clones présents uniquement dans les TEM au temps 1 sont indétectables au temps 2, suggérant qu'ils meurent ou migrent dans les tissus périphériques et 3) en conditions physiologiques, les clones TCM restent majoritairement stables alors qu'une fraction non négligeable des clones TEM apparaît dans la population TCM au temps 2. Enfin, par des expériences de transfert de sous-populations TCM et TEM purifiées, nous avons pu montrer que contrairement aux cellules CD8 TCM, les cellules CD8 TEM sont incapables de monter une réponse secondaire, les cellules mâles étant éliminées par une réponse primaire de l'hôte.

Enfin, en collaboration avec le groupe d'A. Lanzavecchia, nous avons mis en place un modèle d'étude des répertoires des TCR de trois sous-populations T CD4 mémoire spécifiques de la toxine tétanique, dans le sang de donneurs sains : les sous-populations TCM et TEM classiques et la sous-population appelée TFH pour " follicular helper ", sous-population responsable du " help " donné au cellules B dans les centres germinatifs. Les répertoires de ces trois sous-populations au cours du temps, avant, pendant ou après une restimulation sont en cours d'analyse.

2- Etude de la taille du répertoire des cellules B humaines (François Huetz, Annick Lim)

L'étude des répertoires lymphocytaires par la détermination de la taille des séquences CDR3 (Immunoscope) a été principalement appliquée à l'étude des cellules T. Nous avons adapté cette technique aux cellules B de l'homme en y associant une détermination quantitative de l'usage des différentes familles de gène VH par PCR quantitative en temps réel suivie " d'Immunoscope II " qui étend l'analyse des lymphocytes jusqu'à la séquence de leurs réarrangements. Cette technique nous a permis de préciser la taille du répertoire des cellules B et ses variations en condition physiologique. Les résultats obtenus montrent que le répertoire des chaînes lourdes des lymphocytes B est plus diversifié d'environ un ordre de grandeur que celui des chaînes Vß du récepteur (TCR) des lymphocytes T. La contribution des mutations somatiques (caractéristique unique des cellules B) à la diversité du répertoire a été également évaluée.

Dans un deuxième temps, nous avons commencé à étudier les différentes sous-populations de lymphocytes B, comme les cellules mémoires CD27 positives dans des situations pathologiques où leurs proportions sont modifiées. Nous nous intéressons d'une part à certaines maladies auto-immunes, comme le Lupus érythémateux et d'autre part à des déficiences génétiques comme celles d'enfants agammaglobulinémiques qui possèdent un nombre normal de cellules B. Ce travail devrait nous permettre d'avancer dans nos connaissances du mode de fonctionnement des cellules B mémoires dans des conditions physiologiques ou pathologiques.

3- Immunoscope et suivi clinique (Annick Lim, Laurent Ferradini, Christophe Pannetier)

Depuis sa conception (1992), l'Immunoscope a été amélioré sans relâche, afin de le rendre apte au suivi clinique des réponses T chez l'homme, dans diverses situations pathologiques, ou dans des essais d'immunothérapie. Parmi les additions les plus importantes qui ont été réalisées figurent : (a) l'inclusion des méthodes réellement quantitatives ; (b) l'adjonction d'un module de séquençage à haut débit ; (c) la combinaison de l'Immunoscope et du tri de cellules T spécifiques grâce à des tétramères de molécules HLA de classe I chargés avec des peptides définis ; (d) la définition de protocoles adaptés à un suivi clinique prospectif et rétrospectif, pouvant utiliser épisodiquement des prélèvements sanguins de petit volume congelés. C'est ainsi qu'avec le Dr. J.P. Abastado (I.D.M.) l'émergence de CTL spécifiques en réponse au traitement a été recherchée et suivie dans un essai clinique d'immunothérapie anti-cancéreuse

L'évolution des technologies et des instruments apporte son lot d'innovation et permet des gains de performance qu'une robotisation peut encore accroître. Le développement de l'Immunoscope pour les cellules B devrait étendre le champ d'intervention de l'Immunoscope à d'autres situations cliniques et au suivi d'essais vaccinaux.

4- Etude des répertoires des lymphocytes T de souris déficientes en déoxynucléotidyl transférase terminale (Tdt) (Nicolas Fazilleau, Jean Kanellopoulos)

Etudes du répertoire des lymphocytes T de souris Tdt+/+ ou Tdt ko en réponse à des antigènes protéiques présentés par les molécules de classe I ou II du CMH.

Nous avons montré que la taille du répertoire T αβ est diminué de 15 à 20 fois chez les souris Tdt ko par rapport aux souris Tdt+/+. Afin de déterminer quel était l'impact de cette importante diminution de la diversité sur les réponses immunitaires publiques, nous avons comparé les réarrangements Vα et Vβ des TcR sélectionnés par des antigènes protéiques chez les souris C57Bl/6 et C57Bl/6 Tdt ko. Nous avons isolé les lymphocytes T spécifiques d'un épitope bien défini à l'aide de peptides-tétramères de classe I ou II du CMH. Les CDR3α et β des cellules T ont ensuite été séquencés et comparés. Nos résultats montrent que les souris Tdtko possèdent un répertoire public très comparable à celui des souris Tdt+/+. En effet, on retrouve une conservation très nette de l'utilisation des segments V-(D)-J et les CDR3 sont identiques ou très homologues dans les réponses contre des épitopes protéiques. Nous avons analysé l'évolution du répertoire en réponse secondaire en mesurant la maturation d'avidité des lymphocytes T spécifiques au cours des réponses secondaires contre le peptide immunodominant de la nucléoprotéine du virus de l'influenza. Nous avons montré que dans les deux lignées de souris il y avait bien maturation d'avidité en réponse secondaire.

Etude du répertoire des lymphocytes T de souris Tdt+/+ et Tdt ko en réponse à la protéine encéphalitogène MOG

Il a été démontré que l'introduction de la déficience en Tdt dans les souches de souris qui développent spontanément des maladies auto-immunes, avait un effet protecteur et entraînait une diminution de la pathologie auto-immune. Afin d'étudier ce phénomène dans un modèle expérimental qui permette une analyse précise des populations T spécifiques d'un auto-antigène défini, nous avons immunisé des souris Tdt+/+ et Tdt ko par la protéine recombinante MOG soluble qui entraîne une EAE (ce travail est fait en collaboration avec le Dr Danielle Pham Dinh et Cécile Delarasse). Chez les souris C57Bl/6, l'analyse du répertoire des lymphocytes T anti-MOG est grandement facilité car il existe un seul peptide immunodominant dérivé de MOG présenté par une seule molécule de classe II du CMH. L'immunisation des souris Tdt+/+ et Tdt ko par MOG ou son peptide immunodominant entraîne une EAE dans les deux souches. Cependant, les souris Tdt ko ne présentent qu'une poussée de la maladie alors que chez les animaux Tdt +/+, on observe deux rechutes de la maladie. Nous avons comparé les répertoires des lymphocytes T spécifiques de MOG chez les souris Tdt+/+ et Tdt ko. Les répertoires Vα et Vβ publics dans les deux lignées sont très homologues. Nous avons entrepris l'étude des lymphocytes T infiltrant le cerveau des souris Tdt+/+ au cours des poussées évolutives. Deux aspects sont abordés, le répertoire Vα et Vβ ainsi que la spécificité antigénique des cellules T présentes au cours des rechutes. Par ailleurs, des expériences de transfert adoptif de lymphocytes T provenant de souris Tdt+/+ ou Tdt ko sont en cours pour comparer le potentiel régulateur des lymphocytes T des souris Tdt ko.

5- Etude immunologique du mélanome (Laurent Ferradini)

Les réponses immunologiques aux tumeurs, en dépit d'un effort de recherche considérable, restent mal comprises, qu'il s'agisse de réponses spontanées ou stimulées dans des protocoles de vaccination ou d'immunothérapie. En particulier, contrairement aux espoirs que beaucoup nourrissaient, il n'y a pas de corrélation stricte entre régressions tumorales et développement de réponses de cellules T cytolytiques (CTL) spécifiques. Ceci vaut pour le mélanome comme pour d'autres cancers généralement moins bien documentés au plan immunologique.

Deux approches ont été suivies. D'une part, la recherche des cellules T régulatrices dans les prélèvements humains montre que ces dernières sont effectivement présentes, en quantités variables selon les individus. Comme ces cellules sont inhibitrices, il est possible qu 'il faille à la fois stimuler les CTL et contrôler les T régulatrices pour obtenir une réponse anti tumorale efficace. D'autre part, un modèle murin de mélanome inductible a été mis en place. Il s'agit d'un travail de longue haleine qui a consisté à construire des souris transgéniques chez lesquelles des oncogènes sont induits préférentiellement chez les mélanocytes lorsque l'inducteur est inclus dans l'alimentation de l'animal. Ce type de modèle reflète beaucoup plus fidèlement l'apparition du mélanome chez l'homme que le système expérimental habituel qui consiste à greffer la tumeur sur l'animal syngénique. Il est désormais possible de poser, avec ce modèle, des questions très fondamentales, telles que le suivi de l'émergence conjointe de CTL et de cellules T régulatrices lors du développement de la tumeur induite.

6- Etude de la muqueuse intestinale (Delphine Guy-Grand, Orly Azogui, Suzanna Celli)

En l'absence de thymopoïèse, chez les souris nude, des lymphocytes T se différencient ; ils sont nombreux dans l'épithélium de la muqueuse intestinale. L'ontogénie de cette différenciation extrathymique et son importance relative chez les souris euthymiques étaient controversées. Par l'étude de souris portant un transgène exprimant la protéine fluorescente GFP sous le contrôle du promoteur de RAG2, nous avons montré que l'activité de cette recombinase s'exerçait chez les souris sans thymus dans des lymphocytes logés dans la médullaire des ganglions mésentériques et à un degré moindre dans les plaques de Peyer. Cette lymphopoièse suit des étapes ontogéniques proches de celles de la thymopoïèse (la recombinase s'exprimant dans les "double négatives", CD25CD44, et les "double positives"). Cependant, la différenciation en lymphocytes TCRγ apparaît favorisée tandis que la sélection positive des lymphocytes TCRαβ_semble défectueuse, ne générant qu'un nombre restreint de cellules dont le répertoire est oligoclonal. Cette lymphopoïèse ne s'observe pas au niveau des cryptoplaques (formations lymphoïdes muqueuses considérées comme site de précurseurs des lymphocytes intraépithéliaux (LIE)). Les LIE ne sont pas fluorescents et n'ont donc pas subi in situ les processus de recombinaison ; ils proviennent de précurseurs mésentériques migrant à travers le canal thoracique. Fait remarquable, chez les souris euthymiques, la différenciation extrathymique apparaît totalement réprimée sauf en conditions pathologiques de déplétion lymphocytaire sévère (souris irradiées, agées ou génétiquement déficientes en lymphocytes TCRαβ). Ainsi, chez la souris normale, les LIE (y compris les LIE CD8αα) ont une origine thymique.

Légende

Chez la souris nude, exprimant un transgène GFP sous contrôle du promoteur de RAG2, des lymphocytes fluorescents peuplent la médullaire des ganglions mésentériques (Ref : Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. D. Guy-Grand, O. Azogui, S. Celli, S. Darche, MC. Nussenzweig, P. Kourilsky, P. Vassalli. J. Exp. Med. 2003. 197, 1-10).

Mots-clés: Répertoires T et B, mémoire, déoxynucléotidyl transférase terminale, mélanome, intestin


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