Unité: Biophysique des macromolécules et de leurs interactions

Responsable: Patrick ENGLAND

La Plate-forme de Biophysique des Macromolécules et de leurs Interactions fédère un ensemble important de méthodologies permettant d'étudier les propriétés physico-chimiques des macromolécules biologiques et de leurs complexes.

Les 10 appareils gérés par la plate-forme sont accessibles à tous les chercheurs du campus pasteurien ainsi qu'aux laboratoires extérieurs.

Créée en juillet 2002, la Plate-forme de Biophysique des Macromolécules et de leurs Interactions (PFBMI) regroupe un ensemble de technologies physico-chimiques unique en France, permettant de caractériser à la fois les propriétés intrinsèques des macromolécules (stabilité, repliement, auto-association, …) et celles des interactions dans lesquelles elles sont impliquées (paramètres thermodynamiques et cinétiques, stœchiométrie, …).

Technologies disponibles:

* Résonance plasmonique de surface (responsable scientifique : Patrick ENGLAND ; responsable technique : Sylviane HOOS).

L'appareil Biacore 2000 (fabricant : Biacore ; http://www.biacore.com) permet l'analyse des interactions moléculaires en temps réel. Dans ce but, un des partenaires de l'interaction est immobilisé, de manière covalente ou non covalente, et l'autre partenaire passe au contact de cette surface grâce à un flux continu de tampon. Cette technique est particulièrement adaptée à la détermination des vitesses d'association (kon) et de dissociation (koff) entre macromolécules biologiques. L'appareil est entièrement automatisable, ce qui facilite la réalisation de séries d'expériences hautement reproductibles.

* Microcalorimétrie (responsable scientifique : Francis SCHAEFFER ; responsable technique : Sylviane HOOS).

La microcalorimétrie permet la caractérisation thermodynamique directe, complète et précise des interactions entre molécules en solution, et des réactions biochimiques en général. Deux types de calorimètres (fabricant : Microcal ; http://www.microcalorimetry.com/) sont disponibles au sein de la PFBMI, suivant les grandeurs que l'on veut mesurer.

Le calorimètre de titration isotherme (modèle MCS-ITC) : celui-ci est principalement dédié à l'étude des interactions moléculaires. En mesurant la chaleur de réaction à température constante, l'ITC permet la détermination directe de la stœchiométrie (n), de la constante d'équilibre (Ka), et des variations d'enthalpie (Δ H) et d'entropie (Δ S) de la réaction d'association. L'analyse à plusieurs températures donne la variation de la capacité calorifique (Δ Cp) associée à la formation du complexe moléculaire.

Le calorimètre à balayage de température (modèle VP-DSC) : celui-ci est principalement dédié à l'étude de la stabilité thermique des macromolécules et de leurs complexes. En mesurant la variation de la capacité calorifique (?Cp) en fonction de la température, le DSC permet de déterminer directement les variations d'enthalpie (?H) et d'entropie (?S), et la température de demi-transition (Tm), associées à chaque transition structurale.

* Dichroïsme circulaire (responsable scientifique : Alain CHAFFOTTE; responsable technique : Roland NAGEOTTE).

La PFBMI dispose d'un spectropolarimètre muni d'un accessoire "stopped-flow" (modèle CD6 ; fabricant : Jobin-Yvon Horiba) et a acquis en 2003 un appareil de dichroïsme circulaire de nouvelle génération : le modèle Aviv 215, fabriqué par la société Proterion (http://www.proterion.com/avivcd.html).

L'étude des macromolécules (et notamment des protéines) par dichroïsme circulaire permet l'analyse de leur repliement secondaire et tertiaire. Pour les protéines, la mesure du dichroïsme circulaire dans l'UV lointain (180-260 nm) permet de déterminer leur contenu en structure secondaire, alors que les signaux dans l'UV proche (250-330 nm) fournissent des informations sur leur repliement tertiaire.

La stabilité thermique du repliement peut être déterminée en appliquant un gradient de température à l'échantillon. De façon similaire, il est possible de quantifier la stabilité conformationnelle d'une molécule à température constante et les changements structuraux induits par la formation de complexes en effectuant un titrage, respectivement par un agent dénaturant ou un ligand. Finalement, des études cinétiques peuvent être effectuées grâce à un accessoire de mélange rapide ("stopped-flow").

* Spectroscopie infrarouge (responsable scientifique : Alain CHAFFOTTE).

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) permet d'étudier la structure secondaire de macromolécules, en analysant les fréquences d'absorption de certains groupements chimiques caractéristiques (notamment la liaison peptidique en ce qui concerne les protéines). Cette technique apporte des informations complémentaires de celles qui sont fournies par dichroïsme circulaire, et est particulièrement adaptée à l'étude de la structure secondaire des protéines comportant une forte proportion de structures en feuillet ß. L'appareil dont dispose la PFBMI (MB104 ; fabricant : ABB Bomem ; http://www.abb.com/analytical) sera très prochainement doté d'un accessoire de réflectance totale atténuée (ATR).

* Ultracentrifugation analytique (responsable scientifique : Michel GOLDBERG ; responsable technique : Roland NAGEOTTE). 

Le comportement hydrodynamique d'une macromolécule et son coefficient de sédimentation sont liés au volume, à la forme, à la densité et à la masse de la molécule. L'ultracentrifugation analytique permet de mesurer directement la masse d'une macromolécule en solution : s'il s'agit d'un oligomère ou d'un complexe non covalent, le nombre de chaînes associées au sein de la molécule native ou la stœchiométrie du complexe peuvent ainsi être déterminés. Des informations peuvent également être obtenues sur la conformation des macromolécules et la constante d'équilibre des assemblages, ainsi que sur l'homogénéité des échantillons. La PFBMI dispose actuellement d'une ultracentrifugeuse Optima XL-A (fabricant : Beckman-Coulter ; http://www.beckman.com/products/splashpage/proteomelab/default.asp).

* Spectroscopie de fluorescence (responsable scientifique : Fabrice AGOU).

La spectroscopie de fluorescence est une technique versatile qui permet d'analyser, à l'équilibre ou en temps réel, les variations de l'environnement de sondes fluorescentes intrinsèques (notamment tryptophanes pour les protéines) ou extrinsèques (fluorophores synthétiques). Elle peut s'appliquer à la fois à l'étude de la stabilité conformationnelle des macromolécules, à la caractérisation des interactions moléculaires et à la quantification d'activités enzymatiques. Deux types de grandeurs peuvent être quantifiés avec les appareils présents à l'Institut Pasteur: l'intensité et la polarisation (ou anisotropie) de la fluorescence.

La PFBMI dispose à la fois d'un fluorimètre classique à forte sensibilité (Quantamaster C60 ; fabricant : Photon Technology International ; http://www.pti-nj.com/quantamaster.html), et d'un appareil "stopped-flow" (KinetAsyst SF61-DX2 ; fabricant : Hi-Tech ; http://www.hi-techsci.com/) permettant de déterminer les propriétés de réactions rapides avec une résolution de quelques dizaines de milli-secondes.

* Diffusion dynamique de la lumière (responsables scientifiques : Patrick ENGLAND et Ahmed HAOUZ).

L'étude de particules en solution par diffusion dynamique de la lumière permet de quantifier leur vitesse de diffusion, et d'en déduire leurs rayons hydrodynamiques (grandeur qui dépend notamment de leur masse et de leur forme). L'appareil dont dispose l'Institut Pasteur (DynaProMS800 ; fabricant : Proterion ; http://www.proterion.com/ps_dynapro.html) est particulièrement adapté à l'étude de l'homogénéité de préparations macromoléculaires, et permet de détecter la présence d'agrégats de haut poids moléculaire avec une très forte sensibilité.

Activités :

La PFBMI s'est investie en 2003 dans plus de 40 projets, impliquant une quinzaine d'Unités de l'Institut Pasteur et une dizaine de laboratoires extérieurs. L'activité a été à peu près également répartie entre prestations de service et collaborations plus approfondies. De nombreux projets ont été de nature transversale, faisant appel à deux méthodologies ou plus de la PFBMI.

Situation géographique :

Fin 2003, la PFBMI est localisée sur 3 sites : Metchnikoff (bureau de la Plate-forme, résonance plasmonique de surface, microcalorimétrie, dichroïsme circulaire, diffusion dynamique de la lumière), Duclaux (dichroïsme circulaire, spectroscopie infrarouge, ultracentrifugation analytique) et Monod (fluorimétrie).

Légendes des photos :

Fig. 1 : Appareil Biacore 2000 : étude des cinétiques d'interaction entre macromolécules.

Fig. 2 : Calorimétrie de titration isotherme (ITC) : association d'une enzyme et d'un analogue du substrat.

Fig. 3 : Spectre de dichroïsme circulaire en UV lointain de la catalase/peroxidase KatG de Mycobacterium tuberculosis

Mots-clés: physico-chimie, spectroscopie, thermodynamique, cinétique, protéines, sucres, acides nucléiques


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