Unité: Biologie et Génétique du Paludisme

Responsable: Ménard Robert

Nous étudions Plasmodium, le parasite agent du paludisme, et en particulier les stades parasitaires qui infectent le moustique vecteur et le foie de l'hôte mammifère. L'étude porte sur trois axes  principaux: 1) l'étude fonctionnelle des gènes du moustique qui sont différentiellement exprimés pendant l'infection par l'ookinète, le stade parasitaire qui traverse l'épithelium digestif du moustique, 2) la biologie du sporozoïte, le stade parasitaire formé dans l'intestin du moustique et transmis au mammifère, particulièrement ses capacités de mobilité et d'invasion cellulaire, et 3) l'interaction entre le sporozoïte et l'hépatocyte du mammifère, et les produits impliqués dans la signalisation précoce qui s'établit entre ces deux cellules.

1. Caractérisation de gènes d'Anopheles gambiae impliqués dans l'interaction avec Plasmodium falciparum (C. Lavazec, R. Tahar, I. Thiery, C. Bourgouin)

Au cours de son développement sporogonique précoce chez le moustique, le parasite franchit deux barrières : la matrice péritrophique et l'épithélium intestinal. Dans les conditions naturelles de transmission de P.falciparum, parasite de l'homme, une forte réduction parasitaire intervient dans la lumière intestinale de sorte que seule une dizaine d'oocystes arrivent à maturité. Nous avons précédement identifié des gènes d'An. gambiae, le principal vecteur de P. falciparum en Afrique, dont l'expression dans l'intestin du moustique est régulée par  P. falciparum. Parmi ces gènes, deux codant des carboxypeptidases ont été analysés et s'avèrent impliqués dans le développement de P. falciparum chez le moustique. Par ailleurs, une approche par hybridation soustractive et suppressive a été initiée pour identifier des gènes du moustique dont l'expression est modifiée lors des interactions entre les cellules digestives de A. gambiae et les ookinètes de P. falciparum.

2. Génomique fonctionnelle chez An. gambiae (Bertrand Boisson, Jean-Claude Jacques, C. Bourgouin)

Afin de pouvoir tester la fonction de produits du moustique dans les interactions avec Plasmodium, nous développons une approche systématique d'inactivation génique par interférence ARN (RNAi) basée sur l'inoculation d'ARN double brins dans l'hémolymphe de l'insecte. Nous mettons également en place la transgénèse, en utilisant le transposon piggyBac. Le but est de créer des lignées RNAi stables ou de surexprimer des gènes d'intérêt, de manière tissu-spécifique et/ ou inductible, notamment par un repas sanguin.

3. Mobilité en glissant et biologie in vivo des sporozoïtes (F. Frischknecht, R.Amino, B. Martin)

Comme tout stade invasif du phylum des Apicomplexes, le sporozoïte de Plasmodium est capable de ‘glisser' sur un substrat solide et d'envahir toute cellule adhérente. Ces deux processus ont des bases moléculaires communes et résultent de la translocation postérieure d'interactions parasite-substrat/cellule, qui entraîne le mouvement en avant du parasite. Nous avons montré, en utilisant des sporozoïtes exprimant la GFP et en collaboration avec l'Unité d'Analyse d'Images Quantitative et le Centre d'Imagerie Dynamique, que la mobilité en glissant du sporozoïte n'est pas seulement nécessaire à son pouvoir invasif mais est aussi responsable de sa locomotion in vivo, en particulier dans les canaux salivaires du moustique. Cette mobilité active du sporozoïte plasmodial, indépendante du flux salivaire, est la première preuve directe de mobilité active d'un parasite apicomplexe in vivo. Actuellement, nous analysons le processus infectieux du sporozoïte chez l'hôte mammifère, dans la peau et dans le foie.

4. Invasion cellulaire par les sporozoites (P. Baldacci, S. Thiberge)

La protéine TRAP de Plasmodium est une protéine transmembranaire dont la partie cytoplasmique lie le système moteur sous-membranaire du parasite. Nous avons montré que l'entrée des sporozoïtes dans les cellules en culture ou dans ses organes cibles in vivo (glandes salivaires du moustique et foie du mammifère) dépend de deux domaines extracellulaires de TRAP, un domaine de type I de la thrombospondine et un domaine A d'intégrine. Ces deux domaines d'adhésion apparaissent comme les ligands parasitaires, possiblement exclusifs, de la jonction parasite-cellule sur laquelle le système moteur du parasite exerce sa force pour propulser le parasite à l'intérieur de la cellule hôte. Nos résultats récents suggèrent que deux types de récepteurs cellulaires ubiquitaires pourraient jouer un rôle important dans l'internalisation des sporozoïtes.

5. Développement d'outils de modification génétique chez P. berghei (T. Gil Carvalho, S. Thiberge. H. Sakamoto)

Le genre Plasmodium est un terrain propice à la génétique inverse, en raison du taux élevé d'intégration d'ADN par recombinaison homologue et du caractère haploïde de son génome. P. berghei offre le double avantage de permettre une analyse in vivo de l'infection hépatique du mammifère et de constituer un système de génétique moléculaire beaucoup plus rapide et reproductible que P. falciparum. Nous avons mis au point chez P. berghei un système de mutagenèse conditionnelle, basé sur l'utilisation du système Flp/FRT de la levure. Ce système devrait permettre d'analyser la fonction de tout produit parasitaire essentiel, à tout moment du cycle de vie du parasite.

6. Génomique fonctionnelle de l'interaction parasite-hépatocyte (H. Sakamoto, P. Baldacci)

Une fois le sporozoïte dans une vacuole à l'intérieur de l'hépatocyte, il se dédifferencie et génère des dizaines de milliers de mérozoïtes, le stade parasitaire qui infecte les érythrocytes et cause tous les symptomes de la maladie. La plupart des études portant sur les stades hépatiques du parasite ont tenté de caractériser de nouveaux candidats vaccinaux, ainsi que les bases immunologiques de la protection solide induite par l'injection de sporozoïtes irradiés (dont le développement intrahépatique est bloqué). En revanche, notre connaissance du processus de maturation du parasite dans le foie est limitée à quelques études descriptives, et on ne connaît que quelques molécules parasitaires spécifiques des stades intra-hépatocytaires.

En collaboration avec la Génopole nous avons construit des macroarrays contenant 13,000 GSTs, qui sont en cours d'hybridation avec l'ARN de parasites récoltés à divers moments de leur développement (sporozoites, stades hépatocytaires, stades érythrocytaires). De plus, nous tentons de développer une technique de mutagenèse systématique/aléatoire des gènes exprimés aux stades d'intérêt (sporozoites et stades hépatiques). Ce système, associant une mutagenèse d'ADN de Plasmodium par Tn5 chez E.coli et la réintroduction par recombinaison homologue chez le parasite des fragments mutagénisés, devrait permettre de sélectionner les gènes d'intérêt sur la base de leur caractère essentiel ou non.

Mots-clés: Plasmodium, Anopheles, paludisme, stades pré-érythrocytaires, génétique moléculaire, imagerie in vivo, génomique


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