Unité: Biologie Moléculaire du Développement

Responsable: Jean-François Nicolas

Les comportements des cellules et leurs caractéristiques (mobilité, prolifération, forme, polarité, etc.) sont, chez les vertébrés, les composants du développement. Leur contrôle spatio-temporel permet la formation de territoires embryonnaires transitoires d'où émanent des signalisations auxquelles les cellules répondent en modifiant leurs caractéristiques. Des changements dans l'organisation spatio-temporelle des comportements et caractéristiques des cellules créent les conditions de l'évolution des plans de formation des organismes. Pour comprendre ces aspects du développement et leur liaison avec la génétique, nous appliquons les méthodes d'analyse clonale et l'imagerie à plusieurs modèles vertébrés. Notre intérêt se porte sur le système nerveux central, le système musculaire, l'ectoderme de surface et ses dérivés. Nous nous intéressons aussi aux modifications épigénétiques qui perturbent l'expression génique, en particulier des gènes artificiels.

Modifications épigénétiques des transgènes chez la souris

Les transgènes sont presque toujours construits à partir d'éléments isolés de génomes très éloignés. Ceci conduit parfois à des anomalies d'expressions. Ainsi, l'association dans des transgènes de promoteurs de gènes ubiquistes chez les vertébrés et des séquences LacZ d'origine bactérienne se traduit souvent par une absence d'expression chez les souris transgéniques. Plusieurs observations font incriminer le niveau du gène LacZ en dinucléotides CpG dont la méthylation change l'organisation de la chromatine. Pour tester cette hypothèse, des gènes rapporteurs LacZ plus ou moins riches en CpG, construits auparavant au laboratoire, ont été combinés au promoteur d'un gène ubiquiste, la sous-unité α du facteur 1 d'élongation de la traduction et des souris transgéniques ont été produites. Nous avons montré que le transgène dépourvu de CpG n'est plus soumis à la répression observée dans les tissus somatiques avec les transgènes riches ou même appauvris en CpG . La densité en CpG des séquences transcrites des transgènes peut donc avoir un rôle causal dans la répression des gènes. La comparaison des profils d'expression et des profils de méthylation des transgènes a ensuite montré qu'une interférence entre un processus naturel de protection des promoteurs ubiquistes de la méthylation et la méthylation de novo des séquences bactériennes au début du développement est à la base de la répression observée. Cette découverte a d'importantes implications théoriques et pratiques.

Analyses clonales

L'étude de la formation des système musculaire et nerveux à l'aide des méthodes d'analyse clonale s'est poursuivie. L'une des méthodes utilisées, mise au point par le laboratoire, consiste à marquer génétiquement une cellule de l'embryon et à analyser le clone produit à un moment déterminé du développement. Ceci nécessite l'utilisation de souris transgéniques pour un gène particulier appelé LaacZ. La production de librairies de quelques centaines de clones représentatifs de tous les stades du développement permet ensuite de décrire en détail les comportements cellulaires. Une nouvelle méthode d'analyse où les marquages des cellules de l'embryon sont induits temporellement a aussi été utilisée. On exploite ici les propriétés de la recombinase Cre fusionnée à un récepteur aux oestrogènes modifié. Cette dernière méthode nous a permis de décrire complètement les comportements cellulaires durant la morphogenèse et le renouvellement des follicules pileux.

Pour ce qui concerne le système musculaire, l'analyse des librairies de clones LaacZ dans l'embryon à E14,5 et dans le souriceau à P7 s'est poursuivie. Cela a permis de montrer que, tout comme à E11,5 pour le myotome, le système musculaire foetal et adulte est construit à partir de cellules dont le comportement reste cohérent selon l'axe antéro-postérieur depuis avant la bilatéralisation de l'embryon . Cependant, certaines propriétés des clones à E14,5 et à P7 ne peuvent être rapportées à celles des clones à E11,5. Enfin, l'étude de l'organisation clonale des muscles des membres en fonction de leur position selon les axes proximo-distal et ventro-dorsal a commencé. Nous en attendons une meilleure compréhension de la manière dont cette innovation est apparue chez les tétrapodes.

Pour ce qui concerne le système nerveux central, l'étude de clones qui couvrent toute la période du développement du cervelet a révélé plusieurs faits nouveaux. Pour ce qui concerne les relations de lignage des neurones, nous avons montré que (1) les noyaux profonds du cervelet se forment au moins en partie à partir d'un pool de cellules séparé de celui des autres neurones du cervelet, (2) les cellules de Purkinje dérivent systématiquement de progéniteurs multipotents, et (3) les cellules de Golgi constituent une population hétérogène de cellules qui dérivent de la zone ventriculaire. Ces observations permettent de proposer un arbre de lignage plus précis des neurones du cervelet. Pour ce qui concerne les mouvements des cellules, l'observation la plus nouvelle est que les progéniteurs des cellules de la couche de grains ont un arrangement clonal médio-latéral déjà établi dans le tube neural à un moment où leur dispersion rostro-caudale reste importante (). Ceci implique que l'ordre antéro-postérieur des progéniteurs de la lèvre rhombique dans le tube neural est maintenue dans la distribution médio-latérale des cellules de la couche des grains. Cette information suggère que les mouvements morphogénétiques ultérieurs n'altèrent pas cet ordre initial. Il est possible que le maintien des informations de position acquises au stade du tube neural impose une contrainte sur les modes de dispersion des cellules.

Légendes :

Figure 1, a, b, c, d

La diminution du contenu en CpG du gène LacZ lève l'extinction génique dans les tissus somatiques. Marquage X-gal in toto d'embryons à E9,5. a) et b) Les transgènes LacZ (contenu en CpG de 9,24 %) sont inactifs qu'ils soient (a) ou non (b) inclus dans un YAC. c) les transgènes LagZ (contenu en CpG de 1,6 %) ont une expression variégée et d) les transgènes LagoZ (contenu en CpG de 0,06 %) s'expriment à haut niveau.

Figure 2

L'existence de clones courts bilatéraux participant aux muscles à un même niveau rostro-caudal des deux côtés de l'embryon à E14,5 est une des observations qui montre que les muscles foetaux dérivent d'un pool de cellules qui partagent les propriétés des cellules qui, à E11,5, forment le myotome.

Figure 3

Ce clone illustre la contribution au cervelet des descendants d'un précurseur commun à tous les types neuronaux de cette structure, qu'ils soient dérivés de la zone ventriculaire ou de la couche externe des cellules en grains (EGL). La limitation à un domaine médio-latéral restreint de la distribution des neurones de la couche des grains indique que les précurseurs de l'EGL ont un arrangement médio-latéral déjà établi dans le tube neural. Les mouvements morphogénétiques complexes ultérieurs ne perturbent pas cet arrangement initial.

Mots-clés: LaacZ, lignage cellulaire, embryon de souris, analyse clonale, système musculaire, système nerveux central, méthylation d’ADN, CpG, épigénétique, LagoZ, biologie du développement


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