Unité: Biochimie des Interactions macromoléculaires

Responsable: LADANT Daniel

Nous étudions les relations entre la structure et la fonction d'une toxine bactérienne, l'adénylcyclase (AC ou CyaA) produite par Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche. CyaA est capable de pénétrer dans les cellules eucaryotes cibles où, activée par la calmoduline, elle synthétise activement de l'AMP cyclique et altère ainsi le métabolisme cellulaire. Cette toxine présente plusieurs propriétés remarquables et constitue un modèle intéressant pour analyser les mécanismes moléculaires qui gouvernent les interactions protéine-protéine et les interactions protéine-membrane. Les connaissances fondamentales concernant les mécanismes d'entrée de la toxine CyaA dans les cellules cibles et son interaction avec divers effecteurs cellulaires sont exploitées pour différentes applications en vaccinologie et biotechnologie.

Interaction de la toxine CyaA avec son récepteur cellulaire (Cécile Bauche,en collaboration avec C. Leclerc, Unité de Biologie des Régulations Immunitaires, Institut Pasteur, et P. Sebo, Institut de Microbiologie, Prague, République Tchèque)

La toxine CyaA, qui appartient à la famille de protéines RTX (repeat in toxin), est constituée d'un polypeptide de 1706 acides aminés : l'activité catalytique calmoduline-dépendante est localisée dans les 400 premiers acides aminés. La partie C-terminale de 1300 résidus environ est responsable de la liaison avec les cellules cibles et de la translocation du domaine catalytique N-terminal à travers la membrane cytoplasmique de ces cellules. Nous avions antérieurement montré que la toxine CyaA utilise l'intégrine αMβ2 (CD11b/CD18) comme un récepteur cellulaire. Durant l'année passée, nous avons montré que l'interaction fonctionnelle de CyaA avec CD11b/CD18 est dépendante de l'acylation spécifique de la toxine. De plus, une région essentielle pour son association avec l'intégrine a été localisée dans le domaine RTX C-terminal. Ces travaux sont poursuivis actuellement afin de définir plus précisément les résidus et/ou structures impliqués dans l'interaction toxine/récépteur.

Interaction de la toxine CyaA avec des membranes artificielles (Cécile Bauche, en collaboration avec J. Chopineau, Université de Technologie de Compiègne, Compiègne, France).

La toxine CyaA possède la propriété remarquable de pouvoir délivrer son domaine catalytique N-terminal dans le cytoplasme des cellules cibles directement à travers leur membrane cytoplasmique. Notre objectif est d'élucider les mécanismes moléculaires responsables de ce processus. Dans cette optique, nous avons entrepris de caractériser l'association de CyaA avec un modèle de membrane artificielle constituée d'une bicouche lipidique covalemment attachée à la surface d'un appareil de détection optique. L'association de la protéine avec la bicouche peut être détectée par résonance plasmonique de surface. Les propriétés de liaison de CyaA sur ce modèle de membrane biomimétique se sont avérées similaires à celles observées sur une authentique membrane cellulaire. Différentes CyaA modifiées et/ou fragments protéiques sont actuellement caractérisés par cette technique. L'objectif est maintenant d'élaborer un test fonctionnel pour suivre la translocation du domaine catalytique à travers ces membranes supportées, afin d'envisager des études biochimiques et biophysiques détaillées de ce processus.

Toxines CyaA recombinantes pour la vectorisation d'antigènes in vivo (Cécile Bauche ; en collaboration avec C. Leclerc, Unité de Biologie des Régulations Immunitaires, Institut Pasteur, et B. Van den Eynde, Ludwig Institute for Cancer Research, Bruxelles , Belgique)

De par son interaction spécifique avec l'intégrine CD11b/CD18, la toxine CyaA est ciblée de façon très efficace vers les cellules dendritiques (CD). Nous avions antérieurement montré que la toxine CyaA constitue de fait un système vecteur non-réplicatif très efficace pour délivrer des antigènes vers les CD et induire des réponses immunitaires à médiation cellulaire. Nous avons produit des toxines recombinantes portant des épitopes de mélanomes humains insérés dans le domaine catalytique : ces molécules sont capables d'induire chez des souris transgéniques, des réponses CTL spécifiques, et, par ailleurs, sont efficacement présentées par des CD humaines. Ces résultats suggèrent que ces CyaA recombinantes pourraient être utilisées pour induire une immunité antitumorale chez l'homme.

AC comme outil génétique pour l'étude des interactions protéine-protéine (Gouzel Karimova, Nathalie Dautin, Marilyne Davi)

L'adénylcyclase de B. pertussis est un intéressant modèle d'enzyme bactérien activé par une protéine eucaryote, la calmoduline. Le domaine catalytique (AC) présente une structure modulaire, constituée de deux fragments complémentaires (T25 et T18), tous deux requis pour l'activité enzymatique. Nous avons exploité les propriétés de complémentation fonctionnelle entre ces deux fragments pour élaborer un crible génétique (dit " double-hybride bactérien", DHB), permettant, chez E. coli, de détecter des interactions protéine-protéine. En 2003, nous avons développé cette méthodologie pour étudier in vivo l'assemblage de protéines membranaires. Le système DHB a été utilisé, en particulier, pour étudier les associations entre différentes protéines membranaires d'E . coli impliquées dans la formation du septum de division cellulaire (protéines Fts). Nos résultats d'analyse double-hybride ont révélé que ces différentes protéines Fts sont associées par de multiples interactions, qui impliquent des domaines d'interactions spécifiques de chacun des différents partenaires. Nous étudions également l'assemblage d'autres complexes de protéine membranaires, en particuliers des transporteurs de type ABC. Ces travaux indiquent que ce système DHB est particulièrement approprié pour analyser les interactions entre protéines membranaires.

AC comme outil génétique pour l'étude de l'activité de la protéase du VIH (Nathalie Dautin, Gouzel Karimova, Marilyne Davi)

Nous avons antérieurement élaboré un test génétique, également fondé sur la structure modulaire de AC, pour détecter des activités protéolytiques site-spécifique. Cette technique a été développée en particulier pour détecter l'activité protéolytique de la protéase du virus de l'immunodéficience humaine (VIH). En 2003, nous avons exploité cet outil génétique pour analyser les relations structure/fonction de cette protéase, une des cibles majeurs des drogues utilisées en thérapie anti-SIDA. Nous avons également implémenté cette technique afin de pouvoir l'utiliser comme test génétique rapide pour le diagnostic phénotypique de la résistance du VIH aux antiprotéases.

Sélection in vitro d'activité enzymatique adénylcyclase (D. Ladant, en collaboration avec H. Strobel et J.L. Jestin, Unité de Chimie Organique, Institut Pasteur)

Un procédé de sélection in vitro d'activité enzymatique a été élaboré en utilisant comme enzyme modèle, l'adénylcyclase de B. pertussis. Pour cela un analogue biotinylé de l'ATP a été synthétisé et un anticorps qui reconnaît spécifiquement l'AMPc a été sélectionné à partir d'une banque de fragments scFv d'anticorps. Ces molécules ont été utilisées pour sélectionner des phages filamenteux exprimant à leur surface une forme enzymatiquement active de AC. Cette méthode de sélection in vitro est potentiellement applicable à la recherche de nouveaux catalyseurs, actifs en particuliers sur des petites molécules.

Répression catabolique chez E. coli (Agnès Ullmann, Gouzel Karimova)

Un nouveau mutant du gène de la protéine CAP (le récepteur de cAMP) a été isolé et caractérisé : dans la souche exprimant la protéine CAP modifiée, la régulation des opérons cataboliques est devenue indépendante de l'AMPcyclique et leur expression n'est plus soumise à la répression catabolique.

Mots-clés: toxine, adénylcyclase, vectorisation, double-hybride, protéase, vaccinologie, biotechnologie


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