Unité: Biochimie et biophysique des macromolécules

Responsable: Deshmukh N. GOPAUL

Le laboratoire de Biochimie et Biophysique des Macromolécules se consacre a la caractérisation des complexes protéine/ADN et protéine/protéine par la détermination de leurs structures tridimensionnelles aux moyens de la diffraction aux rayons X. Les constantes de fixation ainsi que les paramètres énergétiques sont parallèlement déterminés par la fluorescence et la microcalorimétrie. Parmi les autres projets que nous étudions, il y a aussi des protéines impliquées dans l'invasion du parasite Plasmodium falciparum dans son hôte, des protéines associées a la résistance chez Mycobacterium tuberculosis et des protéines impliquées dans la voie de signalisation de NF-KB.

Le laboratoire de Biochimie et Biophysique des Macromolécules a été crée au début de 2002. La thématique principale est la caractérisation biochimique et structurale des complexes macromoléculaires, notamment dans le cadre des interactions entre les recombinases, de la famille des Tyrosine site-specific recombinases, et leurs substrats ADN. Nous utilisons la cristallographie et la diffraction aux rayons-x pour déterminer les structures des complexes protéine/protéine ou protéine/ADN. Nous avons aussi commencé à travailler en collaboration avec des groupes du campus sur d'autres projets impliquant des interactions protéine/protéine qui interviennent dans la reconnaissance de cellules cibles au cours de la colonisation du Plasmodium falciparum, l'organisme qui est responsable de la Malaria, dans ses hôtes ou vecteurs. Nous avons aussi démarré un projet sur des éléments de complexes participant dans la régulation de la transduction de signaux.

Projet de caractérisation structurale et biochimique des intégrases IntI1 et IntI4.

Le système des intégrons fait intervenir une intégrase IntI et des séquences d'ADN variables attI ou attC. Nous proposons la détermination de la structure tridimensionelle de l'enzyme IntI1 de Pseudomonas aeruginosa et de IntI4 de Vibrio cholerae en présence ou absence de leurs substrats ADN par cristallographie au rayons-x. Nous caractériserons leurs propriètés biochimiques par des mesures des paramètres cinétiques et thermodynamiques avec des substrats fluorescents, par microcalorimetrie ou par Biacore. Nous utiliserons des intermédiaires de recombinaison du type Jonction Holliday comme substrats, ainsi que des ADN linéaires. Cette double approche donnera des résultats qui serviront à mieux comprendre le mécanisme d'établissement de l'équilibre d'isomérisation des intermédiaires et permettra le dévelopement d'inhibiteurs ou d'activateurs, ou des outils moléculaires basés sur les integrases elles memes.

Dans un premier temps, nous procederons a l'élaboration des conditions d'expressions de ces protéines afin de pouvoir produire des quantités suffisantes, de l'ordre du milligramme, pour les essais de cristallisation. L'obstacle majeure étant la solubilité de ces protéines. Nous avons ainsi programmé la construction de plusieurs versions, notamment avec l'adjonction de domaines de protéines plus solubles. Nous espérons pouvoir construire un modèle qui represente les entités moléculaires qui interviennent au cours des différentes étapes de fixation, de la formation du synapse, de l'isomérisation et de la formation des produits recombinés.

L'ensemble des données receuillies seront utilisées pour la synthèse d'inhibiteurs ou d'activateurs des ces recombinases.

Nous avons produit aussi une proteine impliquée dans l'invasion de Plasmodium falciparum. Nous sommes en train de faire des tests de solubilisation pour pouvoir procéder à la cristallisation.

D'autre part nous avons cristallisé et diffracté une protéine impliquée dans la voie de signalisation NF-KB. Les données sont partielles et nous essayons de les améliorer.

Légende :

Reaction pathway for site specific recombination catalyzed by Cre from Phage P1

Photo 1 : (i) Synapse de fixation des substrats ADN par l'enzyme Cre (ii) Coupure initiale par la Try324 conservée (iii) Formation de la jonction Holliday (iv) Isomerisation de la jonction Holliday (v) Coupure du second brin d'ADN par la Tyr324 inactif (vi) Produits Recombinés.

Mots-clés: Site-specific recombinase, integase, crystallographie au rayons-x, structure, biochimie


Rapports d'activité 2003 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr