Unité: Agents Antibactériens

Responsable: COURVALIN Patrice

L'Unité des Agents Antibactériens étudie le support génétique, les mécanismes biochimiques, l'expression hétérospécifique, l'évolution et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes pour l'homme, notamment dans les systèmes suivants : entérocoques et glycopeptides, la résistance aux ß-lactamines et aux aminosides chez les bacilles à Gram négatif ainsi que le transfert de gènes des bactéries aux cellules de mammifères.

1. Résistance aux glycopeptides chez Enterococcus (Florence Depardieu - Bruno Périchon)

La résistance aux glycopeptides chez les entérocoques résulte de la production de précurseurs du peptidoglycane terminés par D-alanyl-D-lactate (D-Ala-D-Lac) (VanA, VanB, et VanD) ou D-Ala-D-sérine (VanC et VanE) pour lesquels les glycopeptides présentent une faible affinité et de l'élimination de ceux terminés par D-Ala-D-Ala synthétisés par la ligase Ddl de l'hôte.

a) Résistance de type VanD. Les souches de type VanD sont constitutivement résistantes à la vancomycine et à de bas niveaux de teicoplanine. Nous avons étudié l'organisation du groupe chromosomique de gènes vanD de E. faecium 10/96A et la régulation de son expression. La séquence a révélé huit cadres ouverts de lecture. La partie distale code pour la deshydrogénase VanHD, la ligase VanD et la dipeptidase VanXD. En amont des gènes de structure pour ces protéines, le gène vanYD présente une mutation avec un changement du cadre de lecture qui entraîne une interruption prématurée de la protéine et l'absence d'activité D,D-carboxypeptidase. L'extrémité 5' contient les gènes vanRD-vanSD codant pour un système régulateur à deux composantes. Une mutation, G184S, adjacente à la sérine impliquée dans la liaison du D-Ala1 de la ligase D-Ala:D-Ala (Ddl) conduit à la production d'une Ddl défectueuse et explique l'absence de précurseurs terminés par D-Ala-D-Ala. Les entérocoques résistants à la vancomycine et présentant une ligase D-Ala:D-Ala non fonctionnelle ne poussent qu'en présence de vancomycine, puisque la résistance est inductible par cette dernière. Chez la souche étudiée, il n'y avait pas de différence dans la nature des précurseurs du peptidoglycane produits par les cellules induites ou non induites, indiquant que le groupe de gènes vanD était exprimé constitutivement. L'insertion de ISEfa4, appartenant à la famille IS605, dans le senseur vanSD entraînait l'expression constitutive de la résistance à la vancomycine.

b) Résistance de type VanG. Nous avons étudié l'organisation génétique, la localisation du groupe de gènes vanG et la régulation de l'expression des gènes de résistance dans deux souches de E. faecalis de type VanG. Le groupe de gènes chromosomiques vanG était composé de gènes recrutés dans divers opérons van. L'extrémité 3' codait pour une ligase D-Ala:D-Ser VanG, une D,D-peptidase bifonctionnelle VanXYG et une sérine racémase VanTG comme chez les souches de type VanC et VanE. En amont de ces gènes de structure, se trouvent les gènes vanWG de fonction inconnue et vanYG qui présentait une mutation avec un changement du cadre de lecture conduisant à une D,D-carboxypeptidase tronquée. L'extrémité 5' contenait trois gènes vanUG, vanRG et vanSG codant pour un système régulateur et qui étaient co-transcrits constitutivement à partir du promoteur PUG. La transcription des gènes vanYG,WG,G,XYG,TG était inductible et initiée à partir du promoteur PYG. Le transfert de la résistance aux glycopeptides de type VanG à une autre souche de E. faecalis était liée au transfert de chromosome à chromosome d'éléments génétiques d'environ 240 kb portant également le gène ermB conférant la résistance à l'érythromycine. La détermination de la séquence des régions flanquantes du groupe de gènes vanG chez les donatrices et les transconjugants a révélé les mêmes répétitions directes de 4 pb et les répétitions inversées imparfaites de 22 pb qui délimitent l'élément.

c) Résistance de type VanB. L'isolat clinique E. faecium BM4524, résistant à la vancomycine et sensible à la teicoplanine, héberge un groupe de gènes vanB chromosomiques qui comprend les gènes régulateurs vanSB-vanRB d'un système à deux composantes. La souche E. faecium BM4525, isolée deux semaines plus tard du même patient, était résistante à haut niveau aux deux glycopeptides. Le gène ddl de BM4525 avait une insertion de deux pb conduisant à une ligase D-Ala:D-Ala non fonctionnelle. La séquence de l'opéron vanB chez BM4525 a aussi révélé une délétion de 18 pb dans le gène vanSB désigné vanSB?. La délétion de six acides aminés chevauchait partiellement le domaine G2 de liaison à l'ATP de l'histidine kinase VanSB? conduisant à une expression constitutive des gènes de résistance. Les protéines VanSB, VanSB? et VanRB ont été surproduites chez E. coli et purifiées. L'autophosphorylation in vitro des histidines kinases VanSB et VanSB? et le transfert du phosphate au régulateur de réponse VanRB n'étaient pas significativement différents. Cependant, VanSB? était déficiente dans l'activité phosphatase de VanRB conduisant à l'accumulation de VanRB phosphorylée. La résistance accrue aux glycopeptides chez E. faecium BM4525 était par conséquent due au manque de production de pentapeptide terminé par D-Ala-D-Ala et à la synthèse constitutive des précurseurs du peptidoglycane terminés par D-Ala-D-Lac, suite à la perte à la fois de l'activité de la ligase D-Ala:D-Ala et phosphatase de VanSB.

d) Conséquence de la résistance de type VanD sur l'activité des glycopeptides in vitro et dans l'endocardite expérimentale à E. faecium. Les conséquences de la résistance de type VanD sur l'activité de la vancomycine et de la teicoplanine ont été évaluées in vitro et dans le modèle d'endocardite du lapin avec un isolat clinique de E. faecium et son dérivé sensible. Les deux antibiotiques étaient inactifs sur la souche résistante in vivo à la fois en termes de réduction des comptes bactériens et de la prévention de l'émergence de sous-populations résistantes aux glycopeptides ; et ce en dépit de l'utilisation de la teicoplanine à des concentrations plus élevées que les CMI des souches VanD. Ceci pourrait être dû à un fort effet inoculum observé également in vitro vis-à-vis des deux antibiotiques. La détection de la résistance de type VanD est donc importante car elle abolit l'activité in vivo des glycopeptides et permet l'émergence de mutants très résistants à ces antibiotiques.

e) Transfert de la résistance multiple aux antibiotiques d'entérocoques animaux à des entérocoques humains dans le tube digestif de souris gnotobiotiques. Les entérocoques multirésistants sont fréquents dans le tractus digestif des animaux. Ces bactéries pourraient servir de réservoir de gènes de résistance pour la microflore digestive humaine. Nous avons montré que divers gènes de résistance, en particulier aux glycopeptides, peuvent être transférés par conjugaison d'une souche de E. faecium d'origine animale à une souche humaine de la même espèce dans le tube digestif de souris gnotobiotiques en l'absence de pression de sélection. La facilité avec laquelle nous avons obtenu le transfert suggère que l'échange de gènes dans les conditions naturelles pourrait se produire plus fréquemment que suspecté.

Résistance aux fluoroquinolones chez Listeria monocytogenes CLIP 21369 (Marc Galimand). L. monocytogenes est largement répandue dans l'environnement et est responsable de graves infections humaines, principalement chez les nouveaux-nés et chez les adultes immunodéprimés. La transmission alimentaire est la principale voie d'acquisition de cette maladie qui diffère des autres infections alimentaires par le haut taux de mortalité (20 à 30% des cas). Bien que les fluoroquinolones ne soient pas préconisées pour le traitement de la listériose, elles peuvent, en raison de leur utilisation croissante, sélectionner des Listeria résistantes. Chez les bactéries à Gram positif, la résistance est due à des mutations dans les cibles intracellulaires des fluoroquinolones, les topoisomérases de type II ou à l'exportation de ces antibiotiques par des pompes d'efflux. La surveillance de la résistance aux antibiotiques des souches de Listeria isolées en France a permis d'isoler parmi 488 souches, cinq L. monocytogenes d'origine humaine résistantes aux fluoroquinolones. Du fait de la décroissance de la résistance à la ciprofloxacine d'un facteur quatre en présence de réserpine, le mécanisme a été attribué à l'efflux actif de ces molécules. La comparaison des séquences déduites du génome de L. monocytogenes EGD de référence avec celles des protéines appartenant à la "Major Facilitator Superfamily" a permis d'identifier le gène lde qui code pour une pompe d'efflux. L'inactivation du gène lde d'une souche résistante par insertion a indiqué que la protéine correspondante était responsable de la résistance. Ces données indiquent que l'utilisation massive des fluoroquinolones peut sélectionner des mutants résistants chez des bactéries qui ne sont pas la cible de ces molécules.

2. Résistance aux aminosides chez les bacilles à Gram-négatif (Marc Galimand - Thierry Lambert)

Malgré le développement de nouvelles ß-lactamines et fluoroquinolones, les aminosides demeurent très utilisés pour le traitement des infections sévères dues à des bactéries à Gram négatif. Chez les bactéries pathogènes pour l'homme, trois mécanismes de résistance aux aminosides sont connus: (i) diminution de l'accumulation intracellulaire de l'antibiotique soit par altération de la perméabilité de la membrane externe, soit par diminution du transport au niveau de la membrane interne, ou par efflux actif, (ii) modification de la cible par mutation au niveau des protéines ribosomales ou de l'ARN 16S, et (iii) modification enzymatique de l'antibiotique. Les microorganismes producteurs d'aminosides ont développé un mécanisme supplémentaire de résistance aux aminosides leur évitant le suicide: la méthylation post-transcriptionnelle de l'ARN ribosomal.

a) Résistance plasmidique de haut niveau par méthylation de l'ARNr 16S chez les entérobactéries. Les aminosides se fixent à un motif hautement conservé de l'ARN 16S ce qui conduit à des altérations des fonctions ribosomales. Le plasmide auto-transférable pIP1204 confèrait chez une souche clinique de Klebsiella pneumoniae une résistance à de nombreux antibiotiques et à pratiquement tous les aminosides par la présence d'un nouveau gène appelé armA (aminoside resistance methylase). Le clonage des armA chez E. coli confère au nouvel hôte une résistance de haut niveau aux désoxystreptamines bisubstituées en positions 4-6. La séquence déduite ArmA présente de 37 à 47% de similitude avec celles des m7G méthylases de l'ARNr 16S des souches d'actinomycetes qui confèrent la résistance aux aminosides chez ces producteurs. Il apparaît donc que la modification post-transcriptionnelle de l'ARNr 16S peut conférer un haut niveau de résistance à un grand nombre d'aminosides chez les pathogènes humains à Gram négatif. Le gène armA est flanqué de séquences d'insertion et est lié au gène blaCTX-M3 qui confère la résistance aux céphalosporines par synthèse d'une ß-lactamase à spectre élargi. Ces éléments sont en faveur d'une dissémination du gène armA et il n'est donc pas surprenant que nous ayons retrouvé ce gène chez différentes espèces d'entérobactéries isolées dans plusieurs pays européens.

b) Caractérisation du gène ant(4')-IIb chez Pseudomonas aeruginosa. La résistance à l'amikacine est due soit à la production de 6'-N-acétyltranférase I, de 3'-O-phosphotransférase IV ou de 4'-O-nucléotidyltransférase II [ANT(4')-II]. Chez P. aeruginosa, ANT(4')-IIa confère la résistance à l'amikacine et aux autres aminosides possédant un groupe hydroxyle en 4'. Nous avons étudié des souches de P. aeruginosa isolées en Bulgarie qui sont résistantes à l'amikacine et qui ne possèdent pas le gène ant(4')-IIa. Le gène ant(4')-IIb a été identifié comme une séquence codante de 756 pb. L'alignement des séquences des protéines ANT(4')-IIb et ANT(4')-IIa indiquait que 156 des 205 premiers acides aminés étaient conservés. La similitude était interrompue au niveau de l'arginine en position 205 tandis que l'homologie au niveau nucléotidique était maintenue le long des gènes. Le déplacement du cadre de lecture était dû à un résidu guanosine supplémentaire par rapport à la séquence déposée dans la banque de données. Ce résultat peut suggèrer que l'extrémité C-terminale des protéines ANT(4')-II n'est pas requise pour l'activité enzymatique. Afin de tester cette hypothèse, un produit d'amplification codant pour une protéine ANT(4')-IIa tronquée des 43 derniers acides aminés a été cloné chez E. coli dans un vecteur d'expression. Cette construction ne conférait pas la résistance aux aminosides. L'extrémité C-terminale semble donc requise pour l'activité enzymatique mais la séquence en acides aminés peut être altérée.

Mots-clés: bactériologie, antibiotiques, résistance, transfert de gènes


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