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     Pathogénie Bactérienne des Muqueuses


  Responsable : LABIGNE Agnès (alabigne@pasteur.fr)


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Les travaux de l'Unité portent sur l'étude du pouvoir pathogène de bactéries colonisant les muqueuses : Helicobacter pylori qui est impliquée dans la genèse des pathologies gastro-duodénales inflammatoires (gastrites chroniques, ulcères peptiques, cancers gastriques et lymphome de MALT), les bactéries du genre Helicobacter associées aux maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) et les Escherichia coli pathogènes qui sont associés à des diarrhées et des infections extra-intestinales (infections urinaires, méningites, septicémies). Génomique fonctionnelle et comparative, études des interactions des bactéries avec les cellules épithéliales et les cellules immunitaires, ainsi que des voies de signalisation qu'elles induisent, analyse des réponses immunitaires associées aux infections, caractérisation des lésions génotoxiques associées au processus inflammatoire, identification de nouvelles cibles thérapeutiques, études épidémiologiques figurent parmi les approches mises en œuvre pour l'étude de ces pathogènes des muqueuses.



  rapport

cale

Bactéries du genre Helicobacter

La prévalence des infections à H. pylori est extrêmement importante puisqu'elle atteint 30 % de la population dans les pays industrialisés et 80 à 95 % dans les pays en voie de développement. C'est très probablement l'infection bactérienne la plus répandue à la surface du globe et les pathologies sévères qu'elle induit constituent un enjeu économique de première importance : rappelons que 10 % de la population dans nos pays souffrent d'ulcères peptiques, et que l'on estime, sur la base de données récentes, que 1 % des personnes infectées par H. pylori développeront une néoplasie gastrique (adénocarcinome ou lymphome).

Différents projets sont à l'heure actuelle poursuivis. Parmi ceux-ci citons : l'étude de l'expression différentielle des gènes de H. pylori en réponse à l'acidité ; les études concernant le métabolisme de l'azote, celui du nickel et du peptidoglycane ; la mise en œuvre d'approches de génomique comparative sur un large échantillon de souches cliniques et de génomique fonctionnelle ; l'analyse du rôle des réponses inflammatoires en relation avec l'adaptation du pathogène à son hôte ainsi que celle des dommages induits au cours des infections chroniques ; la caractérisation des enzymes impliquées dans la réparation de l'ADN chez H. pylori. Seront plus largement décrites ci-dessous les études ayant fait l'objet de travaux publiés en 2003.

Présence d'amidases aliphatiques actives chez les espèces de Helicobacter capables de coloniser la muqueuse gastrique (Stéphanie BURY-MONE et Hilde DE REUSE)

Chez H. pylori, la production d'ammoniac joue un rôle important comme source d'azote, pour tamponner l'acidité gastrique, et un rôle délétère dans la cytotoxicité pour les cellules épithéliales. En plus de l'uréase, connue pour générer l'ammoniac à partir de l'urée, H. pylori possède deux amidases aliphatiques capables, elles aussi, de produire de l'ammoniac : AmiE est une amidase classique alors que AmiF représente un nouveau type de formamidase. Ces deux enzymes appartiennent au réseau de régulation contrôlant les enzymes impliquées dans le métabolisme de l'azote dont l'uréase et l'arginase. Nous avons étudié le rôle des amidases de H. pylori in vivo en testant la capacité de souches dérivées de la souche SS1 et inactivées spécifiquement dans amiE et/ou amiF à coloniser la muqueuse gastrique de la souris. Ces expériences ont été réalisées au cours de monoinfections ou de coinfections avec la souche parentale et la souche double mutante ; elles ont permis de conclure que les amidases ne jouaient pas un rôle essentiel dans la colonisation de la muqueuse gastrique chez la souris. Pourtant, l'étude de la distribution de ces deux gènes révèle qu'ils sont présents dans toutes les souches cliniques de H. pylori testées (53) et qu'ils sont essentiellement retrouvés chez les espèces de Helicobacter capables de coloniser la muqueuse gastrique. Ces observations, ainsi que les résultats des analyses phylogénétiques, suggèrent que ces deux gènes ont été acquis par transfert horizontal, et que cette acquisition pourrait être associée à la pression de sélection associée à l'environnement très particulier que constitue l'estomac.

Caractérisation des rôles de NikR, un autoregulateur dépendant du nickel de H. pylori (Monica CONTRERAS, Jean-Michel THIBERGE et Agnès LABIGNE, en collaboration avec Marie-Andrée MANDRANT - INSA, Villeurbanne)

Le génome de H. pylori contient un gène (HP1338 ou nikR) qui code un homologue du régulateur NikR de E. coli. Nous avons montré que le produit du gène nikR de H. pylori se comportait comme un régulateur pleïotropique dépendant du nickel. La construction d'un mutant isogénique délété du gène nikR a révélé que NikR était essentiel à la survie de H. pylori en présence de fortes concentrations en ions nickel ou cobalt. L'analyse de l'expression différentielle des gènes dans la souche parentale et dans la souche dépourvue de nikR cultivées en présence d'un excès de nickel, a montré que NikR médiait l'expression de gènes soit activés soit réprimés par le nickel. En présence d'un excès de nickel, NikR active la transcription de ureA-ureB (HP72-73), nixA (HP1077), copA2 (HP1072), hpn (HP1427) et hpn-like (HP1432) et répriment l'expression des gènes codant les protéines impliquées dans le métabolisme du fer [pfr (HP0653), fur (HP1027), frpB4 (HP1512), exbB/exbD (HP1339-1340), ceuE (HP1561)], la mobilité [cheV (HP616), flaA (HP0601), flaB (HP0115)], la réponse au [hrcA-grpE-dnaK (HP111-110-109)] ainsi que les protéines de la membrane externe [omp11(HP0472), omp31 (HP1469), omp32 (HP1501)]. Des expériences d'hybridation ADN/ARN à partir de l'ARN extrait de cultures bactériennes indépendantes ont confirmé les résultats du transcriptome pour 10 gènes sélectionnés. En utilisant la protéine NikR recombinante dans des expériences de retard sur gel associant la région intergénique nikR-exbB, des dosages de beta-galactosidase et en étudiant l'expression du gène exbB à l'aide d'un gène rapporteur conférant la résistance à la gentamicine/apramycine, NikR a pu être caractérisé comme un autorépresseur se liant à la région intergénique, et contrôlant l'expression de l'opéron exbB/exbD/tonB qui fournit l'énergie au système de capture du fer ferrique. Tout comme le régulateur Fur de H. pylori, NikR semble jouer le rôle d'un régulateur global impliqué dans le métabolisme de certains cations divalents au sein d'un réseau complexe et hautement régulé.

Réparation de l'ADN chez H. pylori (Chantal ECOBICHON et Agnès LABIGNE, en collaboration avec Pablo RADICELLA - CEA, Fontenay aux Roses)

L'infection chronique à H. pylori engendre un stress oxydatif qui, on le sait, induit des lésions au niveau de l'ADN des cellules hôtes. Nous avons cherché à savoir si l'ADN du pathogène lui-même était également la cible de dommages létaux ou mutagènes du fait de la réponse de l'hôte au stress oxydatif généré. Des mutants Hpnth de H. pylori, incapables de réparer les pyrimidines oxydées du génome bactérien ont été construits. Ces souches mutantes déficientes en endonucléase III (HpNth) présentent un taux de mutations induites ou spontanées élevé, et sont plus sensibles que la souche parentale aux agents oxydatifs ou aux macrophages activés. Bien que, in vitro, le mutant se multiplie aussi bien que la souche parentale, la charge bactérienne du mutant au niveau de la muqueuse gastrique de la souris diminue au cours du temps alors que celle de la souche parentale reste stable. Ces résultats, observés au cours d'infections simples ou au cours de coinfections, démontrent que la carence en endonuclease III conduit à une diminution de la capacité de H. pylori à coloniser et/ou persister au niveau de la muqueuse gastrique. La réponse de l'hôte à l'infection induit donc des lésions oxydatives létales ou pré-mutagènes sur le génome de H. pylori.

Génotoxicité liée à l'infection par H. pylori chez la souris et facteurs de risque (Eliette TOUATI, Valérie MICHEL, Jean-Michel THIBERGE, Agnès LABIGNE, en collaboration avec Michel HUERRE et Patrick AVE)

Au cours de cette étude, nous avons montré que l'infection par Helicobacter pylori induit un effet mutagène au niveau de la muqueuse gastrique, événement qui pourrait être à l'origine de l'initiation de lésions précancéreuses au niveau de l'estomac. L'utilisation des souris transgéniques " Big Blue " qui permettent de détecter et de quantifier des mutations dans n'importe quel organe a permis de mettre en évidence une augmentation d'un facteur 4 de la fréquence de mutants au niveau des cellules épithéliales gastriques après six mois d'infection par H. pylori, comparée à la fréquence de mutants mesurée sur les estomacs de souris non-infectées. L'analyse du spectre de mutations induit révèle la présence de deux événements majeurs de substitution de paires de bases, des transversions GC->TA et AT->CG, dont une partie résulterait de la présence de dommages oxidatifs à l'ADN. L'analyse histologique des estomacs montre l'induction d'une gastrite chronique par l'infection, et souligne l'implication de la réponse inflammatoire de l'hôte dans la génotoxicité observée. Après 12 mois d'infection, une augmentation de la prolifération cellulaire au niveau de l'épithélium gastrique et une induction de l'apoptose sont observées. A partir de ce modèle, nous avons l'intention d'identifier et de déterminer les mécanismes d'action de facteurs de risques potentiels impliqués dans les événements à l'origine du développement du processus de cancérogenèse gastrique. Ces facteurs peuvent être d'origine bactérienne, de l'hôte ou encore environnementaux. Un des premiers facteurs de l'environnement auquel nous nous sommes intéressés est la teneur en sel dans l'alimentation, associée dans la population à une incidence élevée de cancer gastrique. Aucun effet de synergie avec l'infection n'a été observé sur la fréquence de mutants au niveau de l'épithélium gastrique.

La protéine HSP60 induit la production d'IL-6 chez les macrophages par un mécanisme indépendant des voies de signalisation impliquant les récepteurs TLR-2, TLR-4 ainsi que le facteur de différenciation 88 (Alain GOBERT et Richard FERRERO).

Il avait été observé que H. pylori était capable d'induire la production d'interleukine-6 (IL-6) chez les monocytes/macrophages mais également au niveau des tissus gastriques au cours d'une infection chronique ; toutefois, le mécanisme d'induction n'était pas connu. En fractionnant les protéines solubles de la souche 26695 de H. pylori par chromatographie et en testant les différentes fractions sur une lignée de macrophages (RAW264.7) pour l'induction d'IL-6, nous avons pu purifier et identifier par spectrométrie de masse la protéine responsable de cette activité : il s'agit de la protéine de choc thermique HSP60. En accord avec ces résultats, nous avons pu montrer que les extraits bactériens des souches 26695 et SS1 déplétés de HSP60 par chromatographie d'affinité à l'aide d'anticorps dirigés contre HSP60, ont un pouvoir d'induction d'IL-6 chez les macrophages fortement diminué. Par ailleurs, la protéine HSP60 immuno-purifiée stimule la production d'IL-6 chez les macrophages. Au contraire, des macrophages péritonéaux provenant de souris déficientes en récepteurs Toll-like (TLR-2, TLR-4, TLR-2/TLR-4) et en facteur de différentiation 88 produisent la même quantité d'IL-6 que les macrophages parentaux. Ces résultats montrent que l'induction d'IL-6 par HSP60 de H. pylori est indépendante de ces voies de signalisation. Hp-HSP60 induit la synthèse d'ARN messager d'IL-6 et active NF-kappaB dans la lignée RAW264.7. Cette activation est abolie en présence de MG-132, un inhibiteur du protéasome, mais reste inchangée en présence d'inhibiteurs de plusieurs kinases cytosoliques. Cette étude montre le rôle de Hp-HSP60, une protéine très conservée, dans l'induction de l'immunité innée et donc dans la physiopathologie de la gastrite chronique.

Modulation des réponses inflammatoires intestinales lors de l'infection par les bactéries du genre Helicobacter (Nadia CHAOUCHE et Richard FERRERO).

Les bactéries du genre Helicobacter qui colonisent naturellement l'intestin de la souris sont responsables de la genèse de lésions inflammatoires intestinales ; ces infections constituent un modèle expérimental d'étude des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) chez l'homme. Nous avons démontré la capacité des bactéries du genre Helicobacter à induire des réponses pro-inflammatoires dans des lignées épithéliales d'origine intestinale. Il s'avère que certaines de ces bactéries sont également capables de modifier la fonction de barrière de cellules polarisées.

Métabolisme du peptidoglycane chez H. pylori (Ivo G. BONECA et Catherine CHAPUT)

H. pylori semble posséder un nombre restreint de gènes requis pour les voies de synthèse de son peptidoglycane comparé aux autres bactéries. Nous nous sommes intéressés à la caractérisation des hydrolases et des synthétases impliquées dans les étapes d'assemblage périplasmique du peptidoglycane. Ces enzymes sont d'un intérêt majeur puisqu'elles jouent un rôle central dans le mode d'action des antibiotiques de la famille des beta-lactamines. Nous cherchons à comprendre comment les bactéries répondent aux antibiotiques, et comment elles modulent la synthèse de leur peptidoglycane.

Structure du peptidoglycane et résistance à la pénicilline chez Neisseria meningitidis (Ivo G. BONECA, en collaboration avec Aude ANTIGNAC et Muhamed-Kheir TAHA - Unité des Neisseria)

Nous avons caractérisé la composition du peptidoglycane de N. meningitidis en combinant l'analyse par HPLC et la spectrométrie de masse des muropeptides. Il avait été montré que la résistance intermédiaire des méningocoques à la pénicilline résultait de la présence d'un allèle mosaïque du gène penA codant la PBP2 chez ces bactéries. En comparant la structure du peptidoglycane des souches cliniques sensibles et celle de souches de résistance intermédiaire, nous avons pu établir une corrélation directe entre la résistance à la pénicilline et l'accumulation de pentapeptides, suggérant un rôle potentiel de D,D-carboxypeptidase pour la protéine PBP2 chez N. meningitidis.

Le rôle du peptidoglycane dans l'immunité innée (Ivo G. BONECA, en collaboration avec Stéphane GIRARDIN, Philippe SANSONETTI et Dana PHILPOTT)

Les résultats du groupe de Dana Philpott avaient révélé que la reconnaissance des bactéries intracellulaires par les cellules épithéliales se faisait par une voie de signalisation impliquant la molécule NOD1. NOD1, tout comme NOD2, codée par un gène de susceptibilité associé à la maladie de Chron, appartient à une famille de molécules de récepteurs intracellulaires spécifiques (PRR) communément répandues dans les cellules eucaryotes. Nous avons montré que NOD1 et NOD2 répondaient toutes deux au peptidoglycane mais avec des spécificités différentes. NOD2 est synthétisée par les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques et est le récepteur de l'acide muramique dipeptide (MDP), connu pour sa propriété adjuvante. NOD2 signale donc, via la reconnaissance du peptidoglycane, toutes les espèces bactériennes testées et ce, du fait de la nature ubiquiste du MDP. Par contre, NOD1 reconnaît spécifiquement les bactéries à Gram négatif puisque la spécificité est fondée sur la reconnaissance du tripeptide muramique portant un acide aminé diaminopimélique absent chez de nombreuses espèces bactériennes à Gram positif qui, elles, portent un résidu lysine en cette position.

ESCHERICHIA COLI PATHOGÈNES

Bien que de nombreuses espèces bactériennes soient à l'origine d'infections intestinales et extra-intestinales chez l'homme, ce sont les souches pathogènes de Escherichia coli qui sont responsables de la plupart de ces infections. L'Organisation Mondiale de la Santé considère que E. coli est la cause majeure de diarrhées bactériennes dans le monde. Les infections du tractus urinaire tiennent la seconde place des infections bactériennes chez l'homme juste après les infections pulmonaires. E. coli est responsable de plus de 90% des infections urinaires chez les patients non hospitalisés. Enfin, E. coli est la seconde cause de méningites néonatales et est également responsable de nombreuses septicémies. Nos objectifs sont de mieux comprendre les processus pathogènes qui conduisent au développement de ces différentes infections mucosales. Un aspect important de notre recherche concerne la caractérisation des mécanismes qui permettent aux souches pathogènes de E. coli de coloniser les épithéliums et de provoquer des dommages cellulaires. Nous sommes également impliqués dans le développement d'outils pour l'épidémiologie moléculaire et nous avons récemment initié des études de génomique et de protéomique comparatives des souches pathogènes et non pathogènes de E. coli.

Caractérisation des invasines de la famille AfaD (Laurence du MERLE et Chantal LE BOUGUENEC)

Les souches pathogènes de E. coli qui portent des opérons afa sont fréquemment impliquées dans le développement de diarrhées persistantes ou d'infections urinaires récurrentes ou chroniques. Nous avons exploré les voies utilisées par les souches Afa pour entrer dans les cellules de l'hôte et entrepris de déterminer le rôle des invasines AfaD durant l'interaction des bactéries pathogènes avec les cellules épithéliales. Les résultats obtenus ont mis en évidence que les caractéristiques de l'entrée des bactéries par l'intermédiaire de AfaD corroborent l'hypothèse émise de la formation d'un réservoir intracellulaire de bactéries à partir duquel d'autres cycles infectieux peuvent être initiés. En effet, une fois dans le cytoplasme des cellules épithéliales, les bactéries forment des inclusions dans lesquelles elles sont capables de survivre au moins 72 h. La réalisation des tests d'internalisation en utilisant des billes de polystyrène auxquelles ont été couplées des invasines AfaD (purifiées sous forme recombinantes) a montré que cette protéine interagit avec des cellules dérivées des organes cibles des infections causées par les souches Afa (intestin et urothélium). Au cours de ce travail, un récepteur pour les invasines AfaD a, pour la première fois, été identifié. Nous avons montré que ces protéines sont capables de se lier aux intégrines eta 1, des molécules d'adhésion cellulaire présentes au niveau des cellules épithéliales des muqueuses. L'ensemble de ces données suggère très fortement que les invasines AfaD ont un rôle dans la formation de réservoirs bactériens intracellulaires durant le développement à la fois d'infections intestinales et d'infections du tractus urinaire.

Génomique comparative de souches pathogènes et non pathogènes de E. coli (Laurence du MERLE, Christine BERNIER, Soizic BOUCHET et Chantal LE BOUGUENEC, en collaboration avec Anne-Marie GILLES, Evelyne TURLIN, Arnaud FONTANET, les Instituts Pasteur de Dakar et Bangui, et l'Institut Cantacuzène, Bucarest - P.T.R. coordonné par C. LE BOUGUENEC)

Le but de nos travaux est d'identifier des gènes commandant des fonctions conservées dans les souches pathogènes et d'utiliser ces données pour développer de nouveaux outils de diagnostic. En dehors des gènes codant des facteurs de virulence connus (adhésines, invasines, toxines), les îlots spécifiques des souches pathogènes contiennent de nombreuses séquences de fonction inconnue qui présentent des similitudes avec des gènes impliqués dans des voies métaboliques. Cependant, les substrats de ces fonctions métaboliques sont rarement identifiés. Nous avons identifié et caractérisé l'opéron deoK qui confère à la souche la capacité d'utiliser le désoxyribose, dans un îlot de pathogénicité porté par une souche responsable d'une septicémie. Des analyses de séquence ont montré un fort degré de conservation de cet opéron chez les souches de E. coli et ont permis de suggérer que cet opéron a été acquis par transfert horizontal à partir de Salmonella enterica. Des outils biochimiques et génétiques permettant l'identification des souches portant deoK ont été développés et leur utilisation a montré que cet opéron est répandu parmi les souches pathogènes de E. coli associées à des infections intestinales ou extra-intestinales. Un des points importants de ce travail a été de mettre en évidence l'avantage compétitif que confère aux souches la présence de cet opéron dans des cultures mixtes, suggérant un rôle pour cette caractéristique biochimique lors du processus d'infection de l'hôte. Un objectif important est d'identifier d'autres fonctions métaboliques spécifiques des souches pathogènes, ce qui non seulement permettra d'augmenter nos connaissances sur les processus physiopathologiques mis en jeu lors d'infections à E. coli mais permettra également de développer des tests spécifiques, et de réalisation facile, pour l'identification des souches pathogènes. Dans ce but, des analyses comparatives de protéomes et de métabolomes de souches pathogènes et commensales, ainsi que la détermination de la séquence nucléotidique d'îlots de pathogénicité, ont été initiées.

Mots-clés: Helicobacter , gastrite , cancer gastrique , ulcère , lymphome , signalisation , acidité , peptidoglycane , muqueuse , inflammation , génomique , protéomique , régulation uréase , nickel , adhésion , invasion , métabolome , Escherichia coli



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  ONDET Maxence (mondet@pasteur.fr) (1/2 poste après-midi) DE REUSE Hilde, IP, Chargée de Recherche (hdereuse@pasteur.fr)

FERRERO Richard, IP, Chargé de Recherche (rferrero@pasteur.fr)

LABIGNE Agnès, IP, Chef de Laboratoire (alabigne@pasteur.fr)

LE BOUGUENEC Chantal, IP, Chef de Laboratoire (clb@pasteur.fr)

TOUATI Eliette, IP, Chargée de Recherche (etouati@pasteur.fr)

BERNIER-FEBREAU Christine, Doctorante puis postdoctorante

BONECA Ivo, Postdoctorant

BOUCHET Soizic, Etudiante DEA

BREUREC Sébastien, Etudiant DEA

BURY Caroline, DEUG (Université de Nice)

BURY-MONE Stéphanie, Doctorante

CHAOUCHE Nadia, Postdoctorante

CHAPUT Catherine, Doctorante

CHAUDRAY Christelle, Etudiante DEA

CONTRERAS Monica, Doctorante

GOBERT Alain, Postdoctorant (Boursier Roux)

PINTO Alicia Viviana (Université de Buenos Aires, Argentine)

STINGL Kerstin, Postdoctorante

TERRIEN Laure, Etudiante ingénieur

THIBONNIER Marie, Etudiante DEA

du MERLE Laurence, Technicienne Supérieure de Laboratoire (dlaur@pasteur.fr)

ECOBICHON Chantal, Technicienne Supérieure de Laboratoire (ceco@pasteur.fr)

MICHEL Valérie, Technicienne Supérieure de Laboratoire (vmichel@pasteur.fr)

ONDET Maxence, Secrétaire (mondet@pasteur.fr)

THIBERGE Jean-Michel, Technicien Supérieur de Laboratoire (jmthiber@pasteur.fr)


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