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     Rétrovirus & Transfert Génétique - URA CNRS 1930


  Responsable : Jean Michel Heard (jmheard@pasteur.fr)


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Nous utilisons la thérapie génique pour apporter l'enzyme manquante dans le cerveau d'animaux déficitaires afin de prévenir la neurodégénérescence associée aux maladies de surcharge lysosomale. Des modèles de différenciation in vitro et de régénération motrice in vivo nous permettent d'aborder l'étude de la génération de motoneurones à partir de cellules souches adultes. Nous avons élucidé les mécanismes d'action du gène Barhl2 qui participe à l'interprétation des signaux de position fournis aux cellules de la plaque neurale.



  rapport

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L'idée que des stratégies de réparation pourraient être proposées pour le traitement de lésions du système nerveux central (SNC) provient d'observations effectuées au cours de la dernière décennie, parmi lesquelles la greffe de cellules fœtales chez des patients atteints de maladie de Parkinson, la mise en évidence d'une neurogénèse chez les mammifères adultes, et l'isolement de cellules souches neurales de différentes régions du SNC chez l'adulte. Dans le même temps, des vecteurs de transfert de gène capables d'induire l'expression de gènes étrangers dans le SNC sont devenus disponibles.

Une première catégorie de stratégies pour la réparation du SNC repose sur l'apport de facteurs solubles qui pourraient prévenir la mort ou stimuler la repousse axonale. Des sources de facteurs solubles peuvent être créées par la modification génétique de cellules résidentes. Nous abordons ce type de stratégie par le transfert de gène codant pour l'enzyme manquante dans des modèles de maladie de surcharge lysosomale, lesquelles induisent des processus neurodégénératifs graves chez l'enfant.

Une seconde catégorie de stratégies consiste dans le remplacement de cellules disparues. Ceci suppose que le SNC possède chez l'adulte une plasticité suffisante pour incorporer des cellules nouvelles dans l'architecture existante. Il est possible que des cellules neurales progénitrices aient cette capacité, soit spontanément, soit après reprogrammation génétique. Nous posons cette question dans des modèles de réparation motrice chez le rat ou la souris.

La connaissance des outils et des cibles permettant la manipulation du devenir de cellules progénitrices neurales chez l'adulte provient de l'étude du déterminisme de la différenciation cellulaire au cours du développement embryonnaire. B. Durand étudie les mécanismes d'action d'un facteur de transcription à homéodomaine (Barhl2) dont l'expression détermine l'interprétation de l'information de position au cours de la formation de la plaque neurale, ainsi qu'à des étapes plus tardives du développement du cerveau antérieur.

Etude et traitement du processus dégénératif associé aux mucopolysaccharidoses (MPS)

Les résultats de N. Desmaris et A. Cressant obtenus dans des modèles de maladie de Hurler (MPSI) et de Sanfilippo (MPSIII) chez la souris ont montré qu'une injection unique de vecteur AAV2 ou AAV5 dans le cerveau est suffisante pour corriger la pathologie dans la totalité du cerveau, prévenir la mort neuronale et améliorer les performances comportementales des animaux.

Dans la perspective d'essais cliniques, nous examinons actuellement l'efficacité thérapeutique et la tolérance du transfert de gène et de l'apport de l'enzyme manquante dans le cerveau de gros mammifères, selon un protocole cliniquement acceptable. Des vecteurs AAV2 et AAV5 sont utilisés. Les expériences chez des chiens atteints de MPSI ont permis de dresser des cartes de la distribution du vecteur, de l'enzyme et de la correction des lésions dans le cerveau. La mise en œuvre d'un essai clinique sera envisageable lorsque nous serons en mesure de contrôler efficacement la réponse immunitaire induite par l'expression de l'enzyme précédemment manquante, et que des études de tolérance à long terme auront démontré l'innocuité du traitement. Ce programme est mené en collaboration avec les équipes de P. Moullier à Nantes, l'Ecole Vétérinaire de Nantes, un neuropédiatre (Pr. M. Tardieu) et des neurochirurgiens (Prs. M. Tadié et Y. Lajat).

Les mécanismes responsables du transport des enzymes lysosomales dans le cerveau sont inconnus. En utilisant des enzymes fusionnées à la GFP, F. Chen a mis en évidence un transport axonal de ces enzymes et étudie ses modalités. Les expériences sont réalisées en vidéo-microscopie en temps réel sur des neurones en culture. La production de ces molécules marquées chez la souris déficitaire permet par ailleurs de définir les aires cérébrales dans lesquelles l'apport d'enzyme est associé à une amélioration des tests comportementaux.

Etude des modalités de la différenciation de cellules souches adultes en motoneurones.

L'objectif de ce programme est de définir les conditions de différenciation de cellules souches neurales vers des motoneurones. D. Bohl et S. Blanchard exposent des cellules souches provenant de fœtus de rat ou de souris (E13.5) in vitro à des facteurs solubles (RA, Shh) ou à des vecteurs lentiviraux induisant l'expression de facteurs de transcription impliqués dans la différenciation motoneuronale (Pax6, Nkx6.1, Olig2, Ngn2, HB9, Islet1, Lhx3, etc…). La proportion de cellules exprimant des marqueurs de différenciation motoneuronales (HB9, Isl1-2, ChAT) permettra de définir le cocktail optimal pour induire l'engagement des cellules souches dans cette voie de différenciation. Les cellules sont également marquées par la GFP. Une méthode de purification reposant sur l'expression d'un marqueur contrôlée par le promoteur du gène HB9, qui est activé lors de l'engagement dans la voie des motoneurones, sera prochainement disponible.

Les cellules traitées sont transplantées dans des modèles de régénération motrice chez le rat et la souris. Ces modèles ont été créés par S. Liu (rat) et A. Nosjean (souris). Ils consistent en l'insertion de l'extrémité d'un greffon nerveux périphérique préalablement dégénéré dans la corne ventrale de la moelle épinière thoracique (rat) ou dans le noyau du nerf facial (souris). L'autre extrémité du greffon est fixée à un muscle. T. Bréjot et S. Liu ont montré que le greffon stimule intensément la croissance d'axones à partir des motoneurones endogènes. Ceux-ci colonisent le greffon , forment des plaques motrices et induisent une motricité. La greffe de cellules souches neurales naïves GFP+ au contact du greffon montre une survie après deux mois, ainsi que la colonisation du greffon par des axones GFP+, dont certains expriment le marqueur ChAT (figure). Les corps cellulaires ne présentent toutefois pas l'aspect de motoneurones. Le même protocole expérimental est maintenant appliqué à des cellules préalablement traitées pour induire leur engagement dans la différenciation motoneuronale.

Faute d'un contrôle approprié par les centres moteurs supra-spinaux, la connection artificielle de motoneurones à des muscles résulte en des mouvements non coordonnés et non fonctionnels. En collaboration avec l'équipe de P. Brûlet (Département de Biologie du Développement, Institut Pasteur), nous étudions un système de marquage transynaptique de l'ensemble des voies motrices par une fusion GFP-TTC exprimée dans le muscle à partir d'un vecteur AAV1. Notre objectif est de décrire les variations anatomiques accompagnant la réorganisation des connections supra-spinales en réponse à l'entraînement moteur des animaux. La méthode devrait également permettre de déterminer si des cellules transplantées sont capables de s'insérer dans des réseaux neuronaux pré-existants.

Spécification du devenir des cellules de la plaque neurale au cours du développement des vertébrés.

Le devenir des cellules indifférenciées de la plaque neurale proencéphalique est déterminé très précocement, essentiellement en fonction de leur position spatiale. Les signaux de position sont fournis par des gradients de facteurs morphogénétiques tels que Sonic Hedgehog, Fgf8 ou BMPs. L'interprétation de ces signaux par les cellules cibles fait appel à l'expression de facteurs de transcription, dont la plupart comporte un domaine homéotique. B. Durand a récemment isolé un nouvel homéogène chez le xénope et la souris, appelé barhl2. L'expression correcte de l'inhibiteur transcriptionnel Barhl2 est nécessaire à la mise en place de la ligne médiane de la plaque neurale pro-encéphalique, et, à un stade plus tardif, à l'organisation dorso-ventrale du tube neural et à la morphogénèse de l'embryon. N. Duval et N. Offner ont montré que Barhl2 contrôle la prolifération et la survie cellulaire. C'est le premier facteur de transcription décrit dont la fonction participe au déclenchement d'un processus apoptotique. Des arguments, jusqu'ici encore indirects, suggèrent que Barhl2 occupe une position pivot dans les voies de signalisation dépendantes de Sonic Hedgehog et des BMPs.

Légende de la photo: Greffe de cellules souches neurales marquées par la GFP en regard de l'Insertion d'un greffon nerveux prédégénéré dans le noyau du nerf facial chez la souris. Des prolongements axonaux GFP+ sont visibles au niveau du greffon.

Mots-clés: thérapie génique, cellules souches, système nerveux, maladies lysosomales, motricité, gènes homéotiques



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Chantal Brulet, rtg-sec@pasteur.fr Delphine Bohl CR1 INSERM dbohl@pasteur.fr

Béatrice Durand CR1 CNRS bdurand@pasteur.fr

Jean Michel Heard DR1 INSERM jmheard@pasteur.fr

Song Liu CR1 INSERM songliu@pasteur.fr

Anne Nosjean CR1 CNRS nosjean@pasteur.fr

Nathalie Duval CR IP natoche@pasteur.fr
Arnaud Cressant Stage post-doctoral cressant@pasteur.fr

Nicolas Offner Stage post-doctoral offner@pasteur.fr

Thomas Bréjot Thèsard Paris VII tbrejot@pasteur.fr

Fengtian Chen Thèsard Paris VII ftchen@pasteur.fr
Nathalie Desmaris Technicienne Supérieure 2D nchodan@pasteur.fr

Stéphane Blanchard Technicien Supérieur 2D sblancha@pasteur.fr

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