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     Retrovirologie Moléculaire


  Responsable : WAIN-HOBSON Simon (simon@pasteur.fr)


  resume

 

Le travail de l'Unité tourne autour de deux axes. Dans la première thématique, nous continuons avec succès à produire de nouvelles souches de vaccins SIV atténués pouvant fortement protéger contre des souches pathogènes. Dans la seconde thématique, nous cherchons à démontrer qu'in vivo les cellules sont infectées par des centaines de virus dont seule une infime fraction survit dans le but de devenir provirus intégrés.



  rapport

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1. Stoechiométrie de l'infection par VIH-1 ex vivo et in vivo Rodolphe SUSPENE, Michel HENRY, Denise GUETARD et Jean-Pierre VARTANIAN

L'analyse par hybridation in situ par fluorescence (FISH) des splénocytes de 2 patients à différentes étapes de la maladie a montré qu'environ 75 à 80% des cellules infectées in vivo possèdent plus de 2 provirus, avec une moyenne de 3-4 copies provirales par cellule. L'analyse des populations virales après microdissection par laser des noyaux cellulaires possède une très grande hétérogénéité et les séquences obtenues montrent que ces virus VIH-1 sont génétiquement différents avec 29% de variation en acides aminés dans la région hypervariable V1-V2 de l'enveloppe virale. Il ressort de cette hétérogénéité virale la présence de virus mosaïques issus de recombinaisons multiples.

En utilisant des inhibiteurs du protéasome ainsi que de la voie endosomale/lysosomale, nous avons montré qu'une cellule in vivo est susceptible d'être infectée par au moins 300-400 virus génétiquement différents dont très peu seront intégrés et transcriptionellement actifs. Le mécanisme de cette intense variabilité obtenue au niveau d'une cellule reste à être établie. Cette étude permettra dans son ensemble de comprendre la genèse de cette intense variabilité avec notamment la présence de virus recombinants obtenue au niveau de la cellule.

2. Mécanisme des hypermutations rétrovirales de type G->A induites par APOBEC3G, une ADN cytidine deaminase. Rodolphe SUSPENE, Michel HENRY, Denise GUETARD et Jean-Pierre VARTANIAN

L'analyse des populations virales de VIH-1 montre l'existence d'un grand nombre de mutations extensives et monotones de type purine-purine ou dans la majorité des cas la guanine est mutée en adénine (40-100%). Ce phénomène est appelé hypermutations G->A. Ces mutations se réalisent préférentiellement dans un contexte nucléotidique particulier où la base mutée est influencée par le nucléotide en 3'. Ces hypermutations suivent la hiérarchie du contexte nucléotidique suivant: GpG>GpA>GpC>GpT. Ces mutations G->A sont liés à un phénotype VIH?vif, permettant ainsi l'incorporation de la deaminase APOBEC3G dans les particules virales.

Nous venons de montrer le mécanisme enzymatique de la deaminase APOBEC3G qui agit après la synthèse du brin d'ADN (-) de VIH-1 et ceci indépendamment de la transcriptase inverse du virus. Ainsi, ce mécanisme des hyprmutations induites par APOBEC3G peut-être considéré par la cellule comme une immunité innée, poussant le virus à son extinction.

3. Recherche d'une nouvelle forme d'atténuation du virus SIV, par échange promoteur. Nicole CHENCINER, Philippe BLANCOU, Denise GUETARD

Parmi tous les immunogènes VIH/SIV obtenus par délétion de segments de gènes, seuls quelques vaccins vivants atténués protègent contre une épreuve intraveineuse par un isolat pathogène du SIV.Une corrélation inverse entre le degré d'atténuation et l'efficacité de la protection est toujours obtenue. L'échange du promoteur SIV par un autre promoteur viral ou cellulaire peut conférer de nouvelles propriétés au virus chimérique , telle que l'atténuation de la virulence. Si l'expression virale est déplacée vers d'autres types cellulaires (macrophages ou cellules dendritiques) que les lymphocytes T CD4+, l'aide apportée au système immunitaire pourrait aider à contenir l'infection. Nous avons principalement travaillé sur un virus chimérique dans lequel la région core du promoteur SIV située en 3'de nef et en 5' de TAR a été remplacée par le promoteur précoce du cytomégalovirus humain (CMV-IE). Le virus chimérique obtenu (SIV mégalo) pousse à bas titre in vivo -la médiane des titres de virémie sur 15 animaux est < 1000 copies /ml. Cela représente une réduction de 1000 fois du pic de virémie du virus parental. Lors d'épreuve par le virus pathogène SIVmac251, la virémie est 1000 fois inférieure à celle des contrôles naïfs (Blancou et al., J. Virol., Février 2004). Ces résultats confirment que le changement de promoteur peut atténuer le virus obtenu, de nouveaux promoteurs chimériques seront testés dans des études pilotes. Un suivi des singes infectés à plus ou moins long terme sera réalisé pour déterminer les raisons de l'atténuation du SIV mégalo, la nature de la réponse immune induite et les lieux de réplication du virus .

4. Constructions de virus VIS chimères. Compartimentalisation de la réplication virale par le biais de promoteurs ciblés. Mireille CENTLIVRE, Peter SOMMER, Marie MICHEL et Monica SALA-SCHAEFFER

L'objet de notre étude est l'analyse de l'influence de différents promoteurs sur la transcription, la réplication, le tropisme cellulaire et la pathogénicité des virus de l'immunodéficience. Pour développer cette étude in vivo, nous avons construit des virus chimères VIS dans lesquels le génome VIS porte les fonctions Nef et LTR dissociées (STR), ainsi que des promoteurs ciblés : la région promotrice/activatrice des sous-types B, C et E du VIH-1. Ces chimères ont été caractérisées in vitro par des cinétiques de réplication et de compétition. Deux macaques Rhésus ont été co-infectés avec les trois chimères et les paramètres classiques de suivi de l'infection par VIS ont été déterminés sur sept mois. Suite au sacrifice des animaux, l'analyse de la compartimentalisation des souches promoteur-spécifique au niveau de différents tissus est en cours.

5. Contribution des différents compartiments cellulaires à la persistance et la pathogenèse du SIV in vivo Peter SOMMER

Les mécanismes moléculaires responsables de la latence des virus de l'immunodéficience humaine et simienne (HIV et SIV) après leur intégration dans le génome de l'hôte, de même que la contribution des différents compartiments cellulaires à la persistance virale et à la pathogenèse du SIDA, sont encore mal compris. Ces aspects importants de l'infection par HIV/SIV dépendent de l'expression des gènes et de la réplication du virus, ces étapes étant régulées par des éléments du promoteur situé dans le LTR viral. La fonction de ces éléments dépend des facteurs de transcription présents dans la cellule infectée.

Nous avons entrepris la construction de virus SIV chimériques dont les promoteurs sont modifiés par l'insertion d'éléments de régulation constitutifs ou tissu-spécifiques. Cette nouvelle approche nous permettra de disséquer le tropisme cellulaire du SIV in vivo et d'étudier expérimentalement l'impact des différents compartiments cellulaires sur la persistance virale et la pathogénie chez le macaque.

Mots-clés: VIS, VIH, vaccin, infections multipels



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  CHAHINE Michèle, mchahine@pasteur.fr CHENCINER Nicole, Chargée de Recherche, Institut Pasteur, nchencin@pasteur.fr

SALA-SCHAEFFER Monica, Chargée de Recherche, Institut Pasteur, joo@pasteur.fr

VARTANIAN Jean-Pierre, Chargé de recherche, Institut Pasteur, jpvart@pasteur.fr
CENTLIVRE Mireille, Etudiante en thèse, Université Paris 6, mcentliv@pasteur.fr

MICHEL Marie, Etudinte en DEA, Université Paris 7, biomarie@pasteur.fr

SOMMER Peter, Post-Doc, psommer@pasteur.fr

SUSPENE Rodolphe, Etudiant en thèse, Université Paris 6, suspene@pasteur.fr
GUETARD Denise, Ingénieur de Recherche, Institut Pasteur, dguetard@pasteur.fr

HENRY Michel, Technicien de Recherche, Institut Pasteur, michael@pasteur.fr


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