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     Régulation de la traduction eucaryote et virale - CNRS URA 1966


  Responsable : KEAN, Katherine M. (kathiemb@pasteur.fr)


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Nos intérêts portent sur l'étude des mécanismes moléculaires de la synthèse protéique par le ribosome eucaryote, et la régulation de la traduction qui peut avoir lieu selon la structure de l'ARN et lors de l'infection par des virus pathogènes à ARN. Les recherches actuelles sont orientées vers l'étape d'initiation de la traduction, avec une attention particulière pour le rôle des séquences 5'-noncodantes et 3'-terminales des ARNm dans le recrutement de la sous-unité 40S ribosomique.



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1) Données contredisant la relation actuellement admise entre la structure du signal d'entrée interne des ribosomes (IRES) du poliovirus et sa fonction

Les ARNm des picornavirus font partie de ceux qui sont traduits par un mécanisme alternatif, par initiation à partir d'un IRES (pour Internal Ribosome Entry Segment). Les IRES des picornavirus sont longs d'environ 450 nt, structurés en différents domaines. Le domaine E est d'une grande importance pour la neurovirulence du poliovirus (PV), contenant des résidus qui sont mutés dans les trois souches vaccinales développées par Albert Sabin qui ont joué un rôle clé dans le contrôle de la poliomyélite paralytique depuis les années 1950 et dans l'objectif d'éradication mondiale imminente de cette maladie. Il présente également une grande boucle latérale, située non loin de ces nucléotides, dont la structure n'est pas clairement définie. Nous avons mené un programme de mutagenèse dirigée ciblée, couplé à des analyses biochimiques et virologiques, destiné à mieux comprendre la structure de l'ARN du domaine E de l'IRES du PV et le rôle de ce domaine dans la fonction de l'IRES. Nos études avaient déjà souligné que toute cette région joue un rôle dans la neurovirulence du PV et témoigné clairement d'interactions tertiaires intra-domaine. Maintenant, en termes de structure de l'ARN, l'ensemble de nos donnés nous conduisent à proposer l'existence d'un motif tertiaire, dit motif C, critique dans le domaine E de l'IRES, et d'un modèle d'équilibre structural de l'ARN. De plus, nous sommes maintenant en mesure de proposer des mutations candidates des vaccins plus attirantes par leurs phénotypes et stabilité que les originales, soutenues par un rational structural. Enfin, l'analyse de revertants phénotypiques montre qu'un IRES défectueux peut être compensé fonctionnellement par une activité accrue de la protéase virale 2A.

2) Analyse des effets de la carence en oxygène sur la morphologie des cellules hépatiques.

Cette année, nous avons entrepris d'analyser les effets d'une carence en oxygène sur l'expression génétique dans des hépatocytes. En effet, chez les mammifères, le foie, cible naturelle du virus de l'hépatite C (VHC), est à très basse tension d'oxygène. Ceci aurait des conséquences importantes pour la traduction (baisse de taux générale ; maintient d'une traduction sélective de certains ARNm particuliers). Nos premiers résultats montrent que la vitesse de croissance cellulaire n'est pas affectée par une incubation à faible concentration en oxygène pendant au moins 4 jours. Cependant, des changements importants de morphologie cellulaire sont observés. Le tapis cellulaire confluent habituel est remplacé par un réseau filamenteux où le contact entre cellules est maintenu par le développement d'extrusions cytoplasmiques prononcées. Les granules cytoplasmiques lipidiques caractéristiques des hépatocytes sont relocalisés essentiellement aux extrémités de ces extrusions. Les nucléoles grands et condensés sont fragmentés dans des structures nettement plus petites, en corrélation avec une baisse de la quantité d'ARN ribosomique d'environ 50 %. L'ensemble de ces changements ne reflète pas une souffrance cellulaire prononcée, car ils commencent à s'estomper dans les 2 heures qui suivent un retour aux conditions de culture habituelle, et une morphologie normale est rétablie en moins de 6 heures.

3) Analyse génétique de la régulation traductionnelle chez le VHC

Nous avions déjà développé des systèmes de traduction qui récapitulent in vitro les effets de co-opération 5' coiffe-3' queue poly(A) constatés in vivo qui sont à la base d'un modèle " pseudocirculaire " des ARNm. Ces systèmes de traduction nous ont permis de montrer que la traduction efficace sur un ARN " pseudocirculaire " est conservée pour l'ARNm du VHC, bien que la structure de celui-ci est atypique. En effet, la traduction du VHC dépende d'un IRES et, de plus, l'ARN porte une séquence hautement structurée d'environ 100 nt (la région X) à son extrémité 3' plutôt qu'une queue poly(A). En fait, la région X s'est avérée être un modulateur remarquable de la traduction selon la séquence précise de l'IRES du VHC. Cette année nous avons poursuivi notre politique d'accueil de chercheurs étrangers pour promouvoir la recherche collaborative, dans l'optique de déterminer si le domaine II de l'IRES du VHC est impliqué dans la co-opération 5'-3' de l'ARNm du VHC. Pour l'instant, nos travaux menés en commun avec l'équipe de P. Mavromara (Institut Pasteur Hellénique) ne témoignent pas d'un rôle clé de la partie apicale du domaine II.

4) Régulation de la traduction de la protéine FGF6 de la souris

Nous avons choisi d'examiner la régulation de la traduction d'un membre de la famille des facteurs de croissance fibroblastiques - cytokines impliquées dans des processus physiologiques tels l'oncogenèse, l'angiogenèse, la morphogenèse, la régénération et la survie tissulaire. Notre choix s'est porté sur le gène FGF6 à cause de la nature de l'ARNm. En effet, l'ARNm comprend trois sites potentiels d'initiation de la traduction. Nos précédentes données tendaient à démontrer que le profil d'usage de codon d'initiation varie selon le type cellulaire et son état de différentiation. De plus, nous avions trouvé deux ARNm codant la protéine FGF6 qui diffèrent dans la longueur de leurs régions 5' noncodantes. Cette année, nous avons déterminé les conditions requises pour la traduction de ces ARNm. Contrairement à d'autres ARNm cellulaires, il s'avère que ces ARNm ne peuvent pas êtres traduits in vitro dans des systèmes acellulaires classiques, même quand ceux-ci sont supplémentés par des facteurs cytoplasmiques normalement limitants. Par ailleurs, leur traduction in vivo nécessite que ces ARNm aient été synthétisés dans le noyau, une simple transcription cytoplasmique étant insuffisante. L'ensemble de nos résultats suggère que les ARNm codant FGF6 doivent être chargés de facteurs nucléaires afin d'être aptes pour la traduction. Enfin, grâce à l'utilisation d'ARNm bicistroniques, nous avons pu montrer que leurs régions 5' noncodantes contiennent un IRES.

Mots-clés: virus à ARN, Initiation de la traduction, IRES, ARN structure-fonction, co-opération ARNm 5’-3’



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  BALLET, Saskya (sballet@pasteur.fr) KEAN, Katherine M., CNRS, (DR2, chef d’Unité, kathiemb@pasteur.fr) KOMAROVA, Anastassia, post-doctorant

MICHEL, Yanne M., étudiante en thèse

MALNOU, Cécile E., étudiante en thèse

KALLIAMPAKOU, Katerina, thésard visiteur

BROCARD, Michèle, étudiante en DEA

BENMAAMAR, Abel, Ingénieur étudiant

CHARRETON, Sébastien, étudiant en licence professionnelle

COSTES, Audrey, étudiante en DEUG

DEVAUX, Vanessa, étudiante en licence

PAULOUS, Sylvie, (Technicienne Supérieure IP)

ROUX-SCHIEGEL, Mélanie, (Technicienne Supérieure CDD)


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