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     Régulations Transcriptionnelles - CNRS URA 2172


  Responsable : Kolb, Annie (akolb@pasteur.fr)


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Le démarrage de la transcription est la première étape de l'expression génique et la cible de nombreuses régulations. Notre travail porte sur deux thèmes principaux : la transition de la phase exponentielle à la phase stationnaire et les étapes précoces de l'infection par le bactériophage T4. Les facteurs sigma et anti-sigma de l'ARN polymérase jouent un rôle crucial dans la réponse à ces stress.



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L'holoenzyme bactérienne est composée de l'enzyme cœur E constitué de 5 sous-unités (α2 ββ' w) qui porte la machinerie catalytique, et d'un facteur σ , responsable de la liaison au promoteur. La nature du facteur σ détermine la spécificité de reconnaissance de l'ARN polymérase vis-à-vis du promoteur et chaque holoenzyme reconnaît une classe différente de promoteurs. Chez E. coli, il existe 7 facteurs σ qui entrent en compétition pour la fixation à l'enzyme coeur. De nombreux facteurs σ sont induits en réponse aux variations de l'environnement et sont très souvent contrôlés par des facteurs anti-σ .

RECONNAISSANCE du promoteur par les ARN POLYMERASES DE PHASE EXPONENTIELLE ET DE PHASE STATIONNAIRE Eσ 70 ET Eσ S (C. Domecq, S. Lacour, O. Leroy).

Dans leur environnement naturel, les bactéries passent la majorité de leur temps sans se multiplier : en phase stationnaire, elles présentent une résistance accrue à de nombreux stress (variations de température, de pH, d'osmolarité, résistance à l'eau oxygénée et aux antibiotiques...)

La plupart des gènes exprimés en phase exponentielle de croissance sont transcrits par l'ARN polymérase contenant le facteur σ majeur, σ 70. A l'entrée en phase stationnaire, il se produit des changements profonds de l'expression génétique qui sont encore mal compris. Chez les entérobactéries, à côté de σ 70 apparaît un nouveau facteur d'initiation σ S capable de diriger l'ARN polymérase vers une nouvelle classe de promoteurs. Produit du gène rpoS, σ S est également induit en phase exponentielle de croissance à la suite de différents stress physiques ou chimiques et apparaît comme un régulateur central pour la survie des bactéries dans leur environnement naturel, la résistance généralisée aux stress et le contrôle de la virulence.

De tous les facteurs σ , σ S est celui qui présente la plus grande homologie avec le facteur σ majeur, σ 70. La conservation des séquences est particulièrement marquée au niveau des régions impliquées dans la fixation au promoteur (régions 2.4 et 4.2 qui se fixent aux hexamères -10 et -35). Effectivement Eσ S et Eσ 70 se lient préférentiellement aux mêmes séquences consensus in vitro. Pourtant in vivo les deux ARN polymérases reconnaissent des classes distinctes de promoteurs. Les bases de cette discrimination sont encore peu comprises. Les promoteurs qui dépendent de σ S sont en général des promoteurs faibles ; la plupart sont dépourvus d'hexamère -35 consensus, mais possèdent la même séquence optimale pour la boîte -10. Cependant à la différence de Eσ 70, Eσ S a la possibilité de reconnaître une cytosine ainsi qu'une thymine en position -12, ce qui constitue un élément majeur de discrimination pour le promoteur aidB étudié en collaboration avec le groupe de P. Landini (Dubendorf, Suisse). La présence d'un motif TG à une position inhabituelle en amont de la boîte -10 et une cytosine en position -13 favorisent la transcription par Eσ S. L'utilisation de mutants suppresseurs et la mutagénèse dirigée nous ont permis de montrer avec l'équipe de C. Gutierrez à Toulouse que deux acides aminés de la région 2.4 de σ S déterminent au moins partiellement la préférence de σ S pour la cytosine en position -13 du promoteur. Il faut noter que les acides aminés homologues de σ 70 contribuent à établir la forte préférence pour une thymine en position -12.

En plus des éléments de séquence qui sont responsables de la préférence intrinsèque du promoteur pour l'une ou l'autre des holoenzymes, le surenroulement de l'ADN et la présence de facteurs de transcription modulent le démarrage de la transcription des promoteurs dépendants de σ S et peuvent même déterminer le choix du facteur σ .

ROLE DE DEUX FACTEURS ANTI-σ RSD ET ASIA

Les facteurs anti-σ sont des protéines régulatrices qui se lient spécifiquement à un facteur σ et régulent in vivo la disponibilité et l'activité de ce facteur. Nous nous intéressons aux facteurs anti-σ Rsd et AsiA qui tous deux ont la propriété de lier le facteur σ majeur σ 70 mais ont des mécanismes d'action différents.

Compétition entre σS et σ70 pour la liaison à l'enzyme coeur (C. Deshayes, C. Domecq, V. Jaumouillé) : rôle de Rsd

En phase stationnaire E. coli contient au moins deux fois plus de molécules de σ 70 que de σ S. L'enzyme coeur en quantité limitante dans la bactérie a une affinité nettement plus forte pour σ 70 que pour σ S. Il existe donc in vivo des facteurs qui permettent à σ S de capturer suffisamment d'enzyme coeur pour assurer la transcription des promoteurs dépendants de σ S, soit en augmentant l'affinité du coeur pour σ S, soit en diminuant celle de σ 70 . La protéine Rsd exprimée à l'entrée en phase stationnaire pourrait jouer ce rôle car

elle se lie à σ 70, mais non à σ S.. Effectivement en présence d'enzyme coeur dans les essais de compétition entre σS et σ70, Rsd accroît l'efficacité de liaison de EσS à ses cibles. Toutefois in vivo l'expression de la plupart des promoteurs dépendants de σS n'est pas affectée par Rsd. La quantité de σ 70 séquestrée par Rsd est insuffisante pour lui assurer un rôle important dans la partition entre EσS et Eσ70.

AsiA, un inhibiteur puissant des promoteurs à boîtes -10/-35 n'a pas d'effet inhibiteur marqué sur les promoteurs précoces du bactériophage T4 (G. Orsini)

AsiA codé par le gène précoce du bactériophage T4 a été le premier facteur anti-σ découvert. Comme Rsd, AsiA se lie à la région 4 de σ 70, mais pas à σ S. A la différence de Rsd qui dissocie σ 70 de l'enzyme coeur, AsiA n'a pas d'effet sur la formation de l'holoenzyme. Cependant AsiA exerce une très forte répression sur les promoteurs d'E. coli portant les motifs consensus " -10/-35 ". En revanche AsiA n'empêche pas la formation de complexe ouvert aux promoteurs possèdant une région -10 étendue (avec un motif TG en position -15/-14) car les interactions entre la région 4.2 et la boîte -35 ne semblent pas requises dans ce cas. Les promoteurs précoces du phage T4 sont des promoteurs de type bactérien extrêmement forts : en plus d'une boîte -10 proche du consensus, ils possèdent une région -35 très conservée, un motif TG en -15/-14 ainsi qu'un élément UP susceptible de lier les sous-unités alpha de l'ARN polymérase. Peu après l'entrée du phage dans la bactérie, l'expression des promoteurs précoces s'éteint brusquement. On avait cru pendant longtemps qu'AsiA était responsable de ce phénomène. Par des expériences de transcription in vitro, nous montrons que la grande majorité des promoteurs précoces est insensible à l'inhibition exercée par AsiA. La présence de l'élément UP ou celle du motif TG suffit à conférer la résistance à AsiA avec une prépondérance nette de l'élément UP dans cette résistance. La modification naturelle des cytosines de l'ADN du bactériophage T4 en hydroxymethyl cytosines glycosylées atténue faiblement la résistance observée. Nos résultats ainsi que la persistance de l'extinction des promoteurs précoces en l'absence d'un gène asiA fonctionnel, observée par Pène et Uzan (Institut jacques Monod, Paris) exclut l'hypothèse selon laquelle AsiA serait responsable de l'extinction rapide des promoteurs précoces après l'infection.

Regulation par le complexE CRP-AMP cyclique (Y. Huo, collaboration avec Y-P Wang, Université de Pékin)

La protéine réceptrice de l'AMP cyclique (CRP ou CAP) est impliquée dans le catabolisme de nombreuses sources de carbone et contrôle différentes fonctions chez les entérobactéries; son rôle activateur des gènes sensibles à la répression catabolique est bien connu et fait intervenir, pour la plupart des promoteurs, des interactions directes entre l'ARN polymérase contenant le facteur sigma majeur, Eσ 70 et la protéine CRP liée à l'AMP cyclique (CRP-AMPc). CRP intervient aussi dans la reconnaissance de promoteurs, dépendants d'autres facteurs σ .

Le gène de la glutamine synthétase est transcrit à partir de deux promoteurs, l'un faible dépendant de σ 70 est activé par CRP à partir du site de fixation situé en amont du gène, l'autre fort inhibé par CRP indépendamment de la présence du site CRP dépend du facteur σ 54. L'inhibition des promoteurs σ 54-dépendants par CRP constitue un cas de régulation atypique, étudié en collaboration avec Y. Huo et l'équipe de Y-P Wang à l'Université de Pékin.

Mots-clés: ARN polymérase, phase stationnaire, sigma, anti-sigma, AsiA, protéine réceptrice de l’AMP cyclique (CRP), MICROBIOLOGIE MOLECULAIRE, BIOCHIMIE



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Lavenir, Armelle, I.P., alavenir@pasteur.fr Orsini, Gilbert, Université de Paris VII, (Maître de Conférences, orsini@pasteur.fr) Deshayes, Caroline, étudiante, Paris VII

Domecq, Céline, étudiante, Université de Reims

Gerstel , Ulrich, étudiant en thèse, Karolinska Institute, Stockholm, Suède

Huo, Yixin, étudiant en thèse, Universités de Pékin et de Paris VII, Chine

Jaumouillé, Valentin, étudiant, Université de Paris VI

Lacour, Stephan, étudiant en thèse, EAWAG, Dubendorf, Suisse

Leroy, Olivier, Ingénieur vacataire CNRS
Legat, Geneviève, Aide de Laboratoire, I.P.

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