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     Production de Protéines recombinantes et d'anticorps


  Responsable : BÉGUIN Pierre (beguin@pasteur .fr)


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La Plate-forme Production de Protéines Recombinantes et d'Anticorps a pour mission la production et la purification de protéines recombinantes ainsi que la production d'anticorps monoclonaux. Il participe au programme de génomique structurale des Mycobactéries pathogènes. Il produit et caractérise des anticorps monoclonaux pour la recherche, le diagnostic et la thérapeutique



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La Plate-forme n° 5 comporte trois modules : a) Production d'anticorps monoclonaux (responsable Farida Nato, fnato@pasteur.fr); b) Production de protéines recombinantes (responsable Jacques Bellalou, bellalou@pasteur.fr); c) Purification de protéines et production de protéines dans le système baculovirus (responsable Stéphane Pêtres,

Anticorps Monoclonaux

Ce module continue à développer la production d'anticorps monoclonaux et leur caractérisation fine (détermination de constante d'affinité, " mapping " d'épitopes etc) en collaboration avec différentes unités de l'Institut.

L'année 2003 a été marquée par le développement de tests de diagnostic rapide de la peste et du choléra. Ces travaux ont fait l'objet de 3 publications. Des tests basés sur le même principe sont également en cours de développement pour les méningites bactériennes.

Un anticorps monoclonal spécifique de la protéine MSP-1 P19 recombinante de Plasmodium falciparum a été obtenu. Cet anticorps a été cristallisé avec la protéine P19 dans l'Unité d'Immunologie Structurale. Ce travail a abouti à une publication.

Ce module est impliqué dans un Projet Transversal de Recherche, dans la production d'anticorps monoclonaux neutralisant la toxine botulique A. Il développe également des anticorps monoclonaux contre les peptides de la protéine PRPc de la tremblante de mouton.

Cinq nouveaux projets ont été retenus par le comité de pilotage qui s'est réuni en septembre 2003. Il s'agit de produire des anticorps monoclonaux reconnaissant les protéines PfMSP4 et PfMSP5 de Plasmodium falciparum, des candidats vaccins du stade sanguin du paludisme, des anticorps contre le peptide branché SUMO-PCNA, contre le peptide antagoniste de la NEP-enkephalinase en vue d'une immunodétection quantitative, contre le lipopolysaccaride de Shigella dysenteriae 1 afin de produire des tests de diagnostic rapide et contre les antigènes exposés à la surface des hématies parasitées par un clone virulent de P. falciparum formant des rosettes.

Production de Protéines Recombinantes

Le module de Production de Protéines Recombinantes assure la production de cultures bactériennes en fermenteurs de 1 à 300 litres et la préparation d'extraits bruts des culots de cellules qui en dérivent. Il offre à la demande une activité d'expertise pour optimiser la production de protéines recombinantes. Il participe également à un programme de génomique structurale de Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae.

L'objectif commun de ces trois activités est d'assurer dans Escherichia coli des niveaux élevés de production de protéines recombinantes sous forme soluble et correctement repliée. Ces protéines, au besoin marquées à la sélénométhionine, sont utilisées afin d'étudier leur fonction ou de déterminer leur structure par cristallographie aux rayons X ou par RMN. Afin d'optimiser rapidement les paramètres de croissance et permettre une production à haut débit, nous utilisons une batterie constituée de 8 réacteurs miniaturisés, pilotés par un système informatique qui contrôle les principaux paramètres de chaque culture dans des conditions définies et totalement indépendantes. En fonction de l'évolution de la densité bactérienne mesurée en ligne, des séquences de température de croissance avant et après induction peuvent être programmées et réalisées automatiquement. Cette technologie est donc tout à fait adaptée à l'optimisation et à la production de protéines peu solubles. Grâce à l'utilisation de milieu Haute Densité, les rendements en biomasse totale et en protéine recombinante obtenus dans chaque réacteur de 70 ml sont similaires à ceux obtenus pour un litre de culture en fiole agitée. De plus, les conditions ainsi établies peuvent être directement transposées à des cultures en fermenteurs classiques de volume plus élevé.

Afin de pouvoir analyser rapidement la quantité de protéine recombinante produite dans les cultures en fonction des paramètres étudiés, nous développons une technologie simple et fiable de purification analytique en parallèle. D'une part, la lyse mécanique des cellules (ultrasons) est remplacée par une lyse chimique, qui doit être efficace tout en respectant l'activité des protéines et leur caractère soluble ou insoluble. D'autre part, nous testons divers systèmes commerciaux basés sur la chromatographie d'affinité sur métal afin purifier et doser en parallèle la protéine désirée présente dans les échantillons.

Purification de Protéines et Production dans le Système Baculovirus

Le module Purification de Protéines et Production dans le Système Baculovirus a pour mission du purifier les protéines recombinantes présentes dans les culots bactériens obtenus par le module Production de protéines recombinantes. Cette tâche comprend le suivi des rendements et de la pureté des préparations. Outre les demandes de purification ponctuelles, il participe au programme de génomique structurale des Mycobactéries Pathogènes : les protéines purifiées sont transmises à la Plate-Forme Cristallogenèse et Diffraction des Rayons X pour les essais de cristallisation et l'analyse par diffraction des rayons X. Nous disposons d'un système de chromatographie programmable Äkta Explorer et de colonnes permettant de pratiquer divers types de séparation (IMAC, échange d'ions, tamisage moléculaire). A la demande, nous réalisons l'optimisation du processus de purification ainsi que des modifications post-traductionnelles in vitro (ablation du tag, protéolyse ménagée, renaturation). Nous avons ainsi purifié la forme sauvage et un mutant de la chimiokine RANTES, ce qui nécessitait la solubilisation de corps d'inclusion, la renaturation in vitro du polypeptide accompagnée d'une réoxydation des ponts disulfure et l'ablation par protéolyse ménagée de la méthionine amino-terminale. L'authenticité des préparations obtenues a pu être vérifiée par spectrométrie de masse et par leur activité biologique.

D'autre part, le module prend également en charge la production de protéines exprimées à partir de baculovirus recombinants dans des cellules d'insectes. Cette tâche comprend la construction du vecteur recombinant par co-transfection et recombinaison in vivo et la production de protéines à partir de cultures infectées. Des cultures stables de cellules transfectées peuvent également être obtenues.

Photo : Batterie de fermenteurs en parallèle pour les cultures bactériennes à haut débit. A gauche, unité de réacteurs; à droite, unité de contrôle.

Mots-clés: Fermenteurs, protéines recombinantes, cultures automatisées, purification de protéines, baculovirus, anticorps monoclonaux, génomique structurale



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  ESNARD Muriel (mesnard@pasteur.fr) BÉGUIN Pierre, Institut Pasteur (Chef de Laboratoire, beguin@pasteur.fr) MAIMONI-GONCALVES Viviane, stagiaire post-doctorale, Institut Butantan, Brésil (vmaimoni@psteur.fr) BELLALOU Jacques, Ingénieur 3 Institut Pasteur, (bellalou@pasteur.fr)

BONDET Vincent, Ingénieur 2 Institut Pasteur, (vbondet@pasteur.fr)

DARTEVELLE Sylvie Technicienne Supérieure 2D Institut Pasteur, (sdarteve@pasteur.fr)

FRACHON Emmanuel Ingénieur 2 Institut Pasteur, (efrachon@pasteur.fr)

IDJA Andrée Aide de Laboratoire (aidja@pasteur.fr)

MEIER Alain (Ingénieur 2 Institut Pasteur, (ameier@pasteur.fr)

NATO Farida Ingénieur 4 Institut Pasteur, (fnato@pasteur.fr)

PETRES Stéphane Technicien Supérieur 2D Institut Pasteur, (spetres@pasteur.fr)

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