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     Plate-forme de microscopie électronique


  Responsable : Marie-Christine PRÉVOST (mprevost@pasteur.fr)


  resume

 

Créée en 2001, la Plate-forme de Microscopie électronique propose une activité de recherche et de développement de l'analyse ultrastructurale et morphologique en biologie cellulaire, virologie et microbiologie sur différentes thématiques en collaboration avec les chercheurs du campus. A cette activité s'ajoute une méthodologie plus spécialisée pour les localisations immunocytologiques et les cryofixations.

Une activité de service pour le contrôle de différents échantillons biologiques (cellules, cellules primaires, virus, bactéries, champignons).

Une activité d'enseignement et de formation intra muros.



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La PFME (Plate-forme de Microscopie Electronique) créée par la Direction des Equipements et Technologies Stratégiques (S. Cole), est rattachée directement au Département de Biologie Cellulaire et Infection (P. Sansonetti) mais est ouverte à tous. Elle a pour mission d'offrir à la communauté pasteurienne la possibilité d'effectuer des études et des travaux sur des sujets pour lesquels l'approche ultrastructurale aura un rôle essentiel dans la thématique de recherche.

Le laboratoire est réparti sur 3 sites, il est équipé de 4 microscopes électroniques à transmission (CM10 et CM12 de chez Philips, Jem 1010 et 1200EX de chez Jeol) et d'un microscope à balayage à haute résolution (JSM-6700F avec une cathode à émission froide Cold FEG de chez Jeol). Ce microscope à balayage a été installé en novembre 2002. Il nous permet d'obtenir une résolution de 2 à 3 nm à 1Kv pour des échantillons biologiques.

En novembre 2003, nous avons équipé un de nos microscopes électroniques à transmission, le Jeol 1200EX, d'une caméra CCD haute résolution (1,4 millions de pixels), grand angle (grand champ d'observation), d'acquisition en temps réel permettant les réglages et l'observation du microscope électronique à transmission. De plus, cette caméra est équipée d'un logiciel d'analyse et d'archivage d'images avec la version " Pro " (archivage, édition, confection de rapports, ajout d'annotations, mesures interactives et automatiques opérations morpho-mathématiques, filtrages complexes et langage de programmation avancée).

Le laboratoire offre également un ensemble de matériel permettant d'accomplir un éventail assez large de techniques dans différents domaines pour la préparation des échantillons biologiques.

Le plateau technique a également pour mission de former des techniciens, ingénieurs et chercheurs souhaitant s'impliquer dans l'utilisation, de façon autonome, du matériel. Un cours de formation interne à l'Institut Pasteur a été mis en place en 2003 (2 modules : janvier et novembre).

Les travaux sont effectués sous forme de contrats de collaboration. Les objectifs sont de définir le ou les projets avec les chercheurs. Les deux parties s'engagent sur les possibilités, risques et orientations technologiques ainsi que sur la confidentialité, les résultats et la reconnaissance extérieure.

Ces collaborations peuvent faire intervenir différents laboratoires et groupes de recherche. Ces contrats de collaboration sont validés par un Comité de pilotage composé de 3 personnes (Antony Pugsley, Olivier Schwartz et Jean-Pierre Bourgeois).

La Plate-forme propose également, avec l'accord du Directeur des plates-formes technologiques et du Comité de pilotage, de développer de nouvelles technologies et méthodologies dans des domaines plus pointus de l'analyse ultrastructurale telles que les cryotechniques liées à la biologie cellulaire et d'assurer ainsi une veille technologique.

Depuis la création de la plate-forme de microscopie électronique, nous avons engagé des collaborations avec différentes unités du campus sur des thèmes divers (64 contrats de collaboration). Ces thèmes ont nécessité une approche en microscopie électronique aussi bien sur des techniques classiques que sur des techniques plus spécialisées telles que les immunomarquages à l'or colloïdal avec différentes approches (cryocoupes, cryofixation et cryosubstitution).

En 2003, nous avons initié 24 contrats de collaboration.

Voici quelques exemples de projets :

Virologie

Étude sur le VIH

Étude des voies d'entrée du VIH dans des cellules primaires (lymphocytes, macrophages et cellules dendritiques) et rôle de l'entrée par endocytose, phagocytose et macropynocytose. Pour cette étude, nous avons utilisé la microscopie ultrastructurale, l'immunomicroscopie et la microscopie électronique à balayage à haute résolution.

Collaboration avec le groupe d'Olivier Schwartz, Groupe à 5 ans Virus et Immunité.

Étude sur le VHC

Etude de la possibilité d'assembler en pseudo-particules virales chimères (VLPs) des protéines de capside et d'enveloppe hétérologues dérivées du virus de l'hépatite C et du virus GBV-B (un flavivirus non classé) : Examen par coloration négative et immunomarquage avec des anticorps anti-enveloppe de préparations de VLPs purifiées à partir de cellules d'insectes infectées par des baculovirus recombinants qui expriment les précurseurs structuraux chimères.

Collaboration avec le groupe d'Annette Martin, Unité de Génétique moléculaire des virus respiratoires.

Médecine moléculaire

Étude sur le VIH

Analyse structurale et localisation cellulaire du complexe de pré intégration HIV muté ou non dans le DNA flap. Nous avons visualisé, par microscopie électronique et immunogold, des structures juste à l'extérieur des pores nucléaires. Nous venons de visualiser la surface de noyaux purifiés avec la microscopie électronique à balayage à haute résolution qui nous permettra ainsi de faire une analyse immunologique quantitative.

Collaboration avec le groupe de Pierre Charneau, Groupe à 5 ans de Virologie Moléculaire et de Vectorologie.

Pathogenèse microbienne

Étude sur les mycobactéries 

Localisation par immunomarquage de protéines " Sérine-Thréonine-Protéine-Kinases B, D, E et F " chez Mycobacterium tuberculosis qui sont des protéines régulatrices de nombreux processus métaboliques (développement cellulaire, réponse au stress, interactions avec les cellules hôtes) et présumées impliquées dans la pathogénicité.

Collaboration avec le groupe de Stewart Cole, Unité de Génétique moléculaire bactérienne.

Structure et dynamique des génomes

Étude sur la pathogenèse d'Aspergillus fumigatus 

Analyse de la couche externe des conidies de Aspergillus fumigatus jouant un rôle essentiel dans les interactions avec la cellule phagocytaire.

Collaboration avec le groupe de Jean-Paul Latgé, Unité des Aspergillus.

Écosystèmes et Épidémiologie des maladies infectieuses

Étude de l'interaction de Bordetella pertussis avec les cellules trachéales humaines 

Analyse structurale du potentiel invasif et de la survie intracellulaire de Bordetella pertusis, Bordetella parapertusisi et Bordetella bronchiseptica.

Collaboration avec Nicole Guiso et Pascale Gueirard, Unité de recherche Prévention et Thérapie moléculaires des Maladies humaines.

ACTIVITÉS DE SERVICE

La plate-forme de microscopie électronique contrôle différents échantillons biologiques (virus, lignées cellulaires primaires et continues, bactéries et champignons). Ces analyses sont faites pour les unités du campus qui ont besoin de ces contrôles afin de poursuivre leurs investigations de recherche.

ACTIVITÉS D'ENSEIGNEMENT

Les différentes techniques de microscopie électronique sont enseignées aux chercheurs, enseignants et techniciens des laboratoires qui souhaitent utiliser ces technologies de façon autonome.

C'est dans cette optique qu'ont été mis en place deux modules du Cours de formation continue de l'Institut Pasteur en 2003.

Légendes des photos :

Photo1:Cellule dendritique en interaction avec un lymphocyte T4 infecté par HIV en microscopie électronique à balayage. Source : N. Sol, S. Guadagnini, O. Schwartz et M.C. Prévost.

Photo2:Visualisation par Cryo-Microscopie Electronique à Balayage de la surface des conidies d'A. fumigatus (a) souche sauvage G10 et des mutants (b) Δ rodB-02, (c) Δ rodA-47 et (d) Δ rodA-02Δ rodB-26. Taille de la barre 100nm. Source : S. Paris et al.

Mots-clés: Microscopie Electronique, Ultrastructure, Immunomarquage, cryo-coupes, cryo-fixation



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  LHOUMEAU Danièle dlhoum@pasteur.fr   SARR Demba, Stagiaire de l’Institut Pasteur de Dakar PRÉVOST Marie-Christine, Ingénieur technologue position III, Responsable de la Plate-forme de microscopie électronique - mprevost@pasteur.fr

BONNE Isabelle, Ingénieur technologue position II - ibonne@pasteur.fr

BRONNERT Christian, Technicien sup. lab. 2D – cbronner@pasteur.fr

CAYET Nadège, Technicienne de labo. Qual. – ncayet@pasteur.fr

GUADAGNINI Stéphanie, Technicienne sup. lab 1D - sgiroux@pasteur.fr

SCHMITT Christine, Technicienne de labo. Qual. – cschmitt@pasteur.fr


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