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     Membranes Bactériennes


  Responsable : WANDERSMAN Cécile (cwander@pasteur.fr)


  resume

 

L'unité des Membranes bactériennes étudie les transports membranaires chez les bactéries à Gram négatif en développant trois thématiques de recherche : l'acquisition de l'hème dépendante d'hémophore, la sécrétion de protéines dépourvues de peptide signal par les transporteurs ABC et un système à deux composants impliqué dans l'acquisition du fer. Un dernier thème de recherche sur les ABC protéines de fonction inconnue est actuellement développé par Elie Dassa et son équipe qui nous ont rejoints en automne 2003.



  rapport

cale

1) Systèmes d'acquisition de l'hème dépendant d'hémophores (Sylvie Létoffé, Laurent Debarbieux, Philippe Delepelaire, Francis Biville, Annick Paquelin, Frédéric Huché, Virginie Roussel).

Le fer est indispensable à la vie cellulaire comme cofacteur de nombreuses enzymes. Cependant, il n'est pratiquement pas disponible pour les bactéries ni dans l'environnement où il forme des polymères insolubles, ni dans les organismes hôtes où il est lié à des ferri-protéines et des hémoprotéines. Les bactéries possèdent de nombreux systèmes d'assimilation du fer dont la variété et la coexistence chez une même espèce reflètent la variété des situations que rencontrent les microorganismes.

Les systèmes d'acquisition de l'hème et des hémoprotéines sont classés en deux groupes: ceux faisant intervenir des récepteurs de membrane externe qui reconnaissent directement l'hème et les hémoprotéines comme l'hémoglobine ou l'hémopexine, et ceux qui dépendent de petites protéines extra cellulaires appelées hémophores qui fixent l'hème libre ou lié à des hémoprotéines avec une très grande affinité puis le retournent à des récepteurs spécifiques. Les hémophores aussi appelés HasA forment une nouvelle famille d'hémoprotéines sans homologie avec d'autres protéines connues. Ces hémophores que nous avons d'abord identifiés chez S. marcescens sont également présents chez d'autres espèces bactériennes (Pseudomonas. aeruginosa , Pseudomonas fluorescens, Yersinia pestis et Yersinia enterocolitica). Le système Has de S. marcescens est codé par un opéron régulé par la carence en fer (Fig1). Il comprend HasR, le récepteur de l'hémophore, HasA, l'hémophore, HasD et HasE les protéines de membrane interne du transporteur de l'hémophore et HasB, un homologue de TonB specifique de HasR. Le récepteur HasR utilise l'énergie dérivée de la force proton motrice de la membrane interne et dépend du complexe TonB-ExbBD, qui transmettrait cette énergie. C'est une propriété commune à de nombreux récepteurs de la membrane externe dont la structure tridimensionnelle a été déterminée dans quelques cas et montre un domaine N-terminal périplasmique fermant le tonneau beta du récepteur, et pouvant entrer en interaction avec la protéine TonB.

La structure tridimensionnelle de l'holoprotéine (Fig.2) ainsi que la mutagenèse en alanine des résidus ligands axiaux du fer ont montré que le fer de l'hème est lié par l'histidine 32 et la tyrosine 75. Une deuxième histidine (83) forme une liaison hydrogène avec la tyrosine 75 et peut devenir ligand de l'hème après mutagenèse des deux autres résidus. Ces études sont faites en collaboration avec le groupe de RMN de l'Institut Pasteur qui est en train de finir la structure 3D de l'apo-hemophore. L'apo et l'holo-hémophore se fixent de façon TonB indépendante, avec des affinités semblables (5nM) sur le récepteur à un même site ou à des sites chevauchants. Ce site sur HasA est constitué de deux domaines de liaison, chacun situé sur un feuillet beta de la protéine (étoiles sur la fig.2). Nous faisons l'hypothèse que la fixation de l'hémophore par ses deux sites de liaison déforme la protéine de telle façon qu'elle transferre son hème.

Le transfert de l'hème depuis une protéine de très haute affinité HasA (Kd 10-11M) à une protéine d'affinité plus faible HasR (Kd d'environ 10-6M) est problématique.

Des comparaisons des profils spectrophotométriques des protéines purifiées HasA, HasR et du complexe HasA-HasR chargés d'hème suggèrent que le transfert d'hème d'une protéine à l'autre se produit " in vitro " sans apport d'énergie. La structure 3D du complexe hémophore-récepteur réalisée à Constance en Allemagne dans le laboratoire de W. Welte nous permettra de déterminer les résidus ligands du fer dans le complexe. Après transfert de l'hème à HasR, l'apo-hémophore reste à la surface cellulaire. Comme l'apo- et l'holo-hemophores ont la même affinité pour le récepteur, on se demande comment se fait l'échange entre hémophores vides et chargés sur le récepteur. Nous venons de montrer que l'éjection de l'apo-hémophore nécessite de l'énergie et le transport concomittent de l'hème. Le recyclage des hemophores requiert une plus grande concentration en complexe TonB-ExbB-ExbD que l'acquisition directe d'hème sans l'intervention d'hémophore.

Le déchargement de l'hème des hémoprotéines est un processus qui intervient dans de nombreuses régulations chez les eucaryotes et dans le recyclage hépatique de l'hémopexine, transporteur sérique de l'hème. Les mécanismes de déchargement sont peu compris et nous espérons que HasA pourra servir de système modèle dans ces études.

Deux gènes régulateurs hasI and hasS sont localisés en amont de l'opéron has codent respectivement pour un facteur sigma appartenant à la famille des sigmas ECF (pour Extra cytoplasmic function) et son anti-sigma. La fixation de l'hémophore chargé d'hème sur le récepteur HasR inactive l'anti-sigma et permet à HasI d'initier la transcription de l'opéron has. La fixation de l'hème seul sur HasR ne l'induit pas. Ceci montre que l'inducteur et le substrat transporté sont des molécules différentes. A l'aide d'une collection de mutants de HasA obtenus par insertion aléatoire de pentapeptides, nous cherchons quel est le stimulus moleculaire qui déclenche l'induction.

HasI est régulé par le répresseur Fur chargé de fer et n'est pas autorégulé. Nous venons de mettre en évidence une régulation entièrement nouvelle pour l'anti-sigma. Il est régulé par HasI et par conséquent soumis à la même cascade d'induction déclenchée par la fixation de l'holo-hémophore sur son récepteur.

Ceci montre que le système Has est régulé positivement et négativement par la présence d'hème. Quand il y a assez d'hème, HasS s'accumule sous une forme inactive qui devient instantanément active dès que HasR n'est plus occupé par holo-HasA.

2) La sécrétion des protéines par les transporters ABC (Sandra Cescau, Laurent Debarbieux et Philippe Delepelaire)

La voie ABC (pour ATP Binding Cassette) ou voie de type I est l'une des quatre voies majeures de sécrétion des protéines actuellement connues chez les bactéries à Gram négatif. Comme la voie III, la voie I ne fait intervenir ni peptide signal N-terminal ni appareil de sécrétion Sec. Elle est donc indépendante du plus universel mécanisme de translocation des polypeptides.

De nombreuses protéines telles que des hémolysines, des bactériocines, des protéases, des lipases, des protéines de couche S et des hémophores empruntent la voie I qui est caractérisée par la présence, dans le transporteur, d'une ATPase membranaire appelée protéine ABC. Ces protéines sont impliquées dans de très nombreux transports membranaires dont certains sont essentiels à la vie cellulaire. Etant donné leurs fonctions capitales, il n'est pas surprenant, grâce aux progrès de la génétique humaine, de voir ces protéines associées à un nombre sans cesse croissant de maladies héréditaires graves. L'utilisation de drogues anti-tumorales et d'antibiotiques a aussi favorisé la sélection de protéines ABC fonctionnant comme pompes d'efflux de ces agents thérapeutiques chez les procaryotes et les eucaryotes. Les multirésistances qui en découlent sont une menace importante de santé publique.

Notre équipe a montré que cette voie permet la sécrétion de protéines de fonction et d'origine très diverses ayant toutes un signal C-terminal. Puis nous avons établi que les transporteurs comprennent outre la protéine ABC, deux autres protéines de l'enveloppe bactérienne dont une protéine de la membrane externe appartenant à la famille TolC , une protéine multifonctionnelle nécessaire à l'efflux des drogues et des sels biliaires (Fig.1).

Le signal de sécrétion C-terminal reste exposé sur la protéine grâce à des chaperons cytoplasmiques nécessaires à la sécrétion. Ce signal reconnaît la protéine ABC, module l'hydrolyse de l'ATP et induit la formation d'un complexe multiprotéique. L'interaction entre protéine ABC et substrat implique plusieurs sites que nous tentons de caractériser. L'identification de ces sites pourrait initier une recherche de drogues inactivant des protéines ABC impliquées dans la résistance à de nombreux agents thérapeutiques.

Nos futures recherches s'orientent d'une part vers le rôle des chaperons et l'état conformationnel des exoprotéines compatible avec la sécrétion, d'autre part vers la structure et la dynamique d'association du transporteur en un complexe multiprotéique. Nous nous tournons vers des approches biophysiques pour visualiser ces complexes purifiés: cryomicroscopie et cristallisation. Pour cela nous avons entrepris des collaborations avec le laboratoire de Microscopie Electronique de l'Institut Pasteur et à l'extérieur avec les groupes de Glaeser à Berkeley USA, de T. Rappoport à Harvard USA.

3) Système à deux composants impliqué dans le contrôle de l'acquisition du fer (Francis Biville)

Ce système est présent chez de nombreuses bactéries. YgiY présente des homologies de séquence avec les kinases, senseurs membranaires des systèmes à 2 composants et YgiX avec les activateurs transcriptionnels phosphorylables. Chez E. coli, ce système est impliqué dans la régulation de nombreuses fonctions telles que la motilité, la formation de biofilms et l'acquisition du fer. Nous avons montré que l'inactivation de YgiY permet l'utilisation du fer complexé au pyrophosphate en l'absence d'enterobactine qui extrait le fer lié au pyrophosphate. Ceci suggère que YgiY/ YgiX régule un système d'acquisition du fer non encore identifié. YgiYpossède un motif EXXE présent sur plusieurs protéines fixant le fer. Nous testons actuellement si YgiY peut fixer du fer radioactif. Nous essayons également de caractériser le chelateur de fer potentiellement produit par le mutant ygiY.

4) Les protéines ABC de fonction inconnue (Elie Dassa, Dorothée Murat et Laurent Goncalves)

Des protéines ABC dépourvues de domaines transmembranaires sont impliquées dans la régulation de l'expression génétique chez les eucaryotes. Nous avons montré que de nombreuses ORF bactériennes de fonction inconnue sont homologues à ces protéines. Nous étudions 4 ORF de cette famille chez Escherichia coli, codées par uup, ybiT, yjjK et yheS. Nos résultats montrent que 3 sont impliquées dans la compétitivité des bactéries et dans la dynamique des éléments mobiles de leur génome. Nos travaux visent à :

- Caractériser le rôle de ces protéines et comprendre les aspects moléculaires de leur fonctionnement ;

- Etudier l'histoire évolutive des systèmes ABC et comprendre les modalités de leur variété fonctionnelle.

Légendes des photos :

Photo : 1. : Système d'acquisition de l'hème dépendant d'hémophore S. marcescens

Photo 2 : Structure tridimensionnelle d'hémophore S.marcescens .

Mots-clés: Transport membranaire, acquisition du fer, hémophore, protéine ABC



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  THEPAUT Sylvana sthepaut@pasteur.fr BIVILLE Françis, Chargé de Recherche IP, fbiville@pasteur.fr

DASSA Elie, DR2 INSERM elidassa@pasteur.fr

DEBARBIEUX Laurent, Chargé de Recherche IP, deblaure@pasteur.fr

DELEPELAIRE Philippe, DR2 CNRS, pdelep@pasteur.fr

WANDERSMAN Cécile, Chef d'Unité IP, cwander@pasteur.fr
CESCAU Sandra, Etudiante Doctorat Université Paris 7, scescau@pasteur.fr

HUCHE Frédéric, Etudiant Doctorat Univ. Paris 7/ Boursier Univ.Constance, huche@pasteur.fr

MURAT Dorothée, Etuiante Doctorat Univ. Paris VII dmurat@pasteur.fr

ROUSSEL Virginie, Etudiante DEA Université Paris 6, vroussel@pasteur.fr
LETOFFE Sylvie, Ingénieur IP, sletoffe@pasteur.fr

GONCALVES Laurent, Technicien IP lgoncalves@netcourrier.com

PAQUELIN Annick, Technicienne CNRS, apaquel@pasteur.fr

GUICHARD Fernande, Agent de laboratoire IP, fguichar@pasteur.fr

LEBON Gisèle, Aide de laboratoire IP, glebon@pasteur.fr

MALBERT Marie-Jeanne, Aide de laboratoire IP, mjmalber@pasteur.fr

RAJARATNAM Thomas, Responsable de préparation IP, tomaraja@pasteur.fr

THEPAUT Sylvana, Secrétaire IP, sthepaut@pasteur.fr

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