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     Immunologie Virale


  Responsable : VIRELIZIER Jean-Louis (virelizi@pasteur.fr)


  resume

 

Le laboratoire concentre ses recherches sur la Relation Hôte/Virus, en particulier sur l'entrée virale, dans les modèles du VIH, du virus de la dengue et de l'hepatite C. Ses principales approches en 2003 ont été: Signaux induits par l'interaction des protéines d'enveloppe virales avec les récepteurs membranaires (CCR5, CXCR4, CD4 , DC-SIGN) ; Création de puces cADN humaines originales pour caractériser les réponses transcriptionelles des lymphocytes T à l'infection virale ; Rôle du récepteur-lectine DC-SIGN dans le transfert et la dissémination virale. Imagerie dynamique des évènements précoces de l'infection , directe ou après transfert du VIH aux lymphocytes ; Anomalies génétiques de CXCR4 dans un syndrome immuno-hématologique humain (WHIM).



  rapport

cale

Changements de distribution, de conformation et d'interaction membranaires de CCR5 et CXCR4 en réponse à l'activation.(Françoise Bachelerie, Karl Balabanian, Bernard Lagane, Thierry Planchenault, Isabelle Staropoli).

Ces phénomènes sont étudiés en relation avec leur rôle biologique et physiopathologique associé en particulier à la pathogénie de deux syndromes immunitaires : le SIDA et le WHIM.

La fixation de la protéine d'Enveloppe (Env) du Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH) initiée sur le récepteur primaire CD4 induit un changement de conformation de la sous-unité de surface de l'Env qui permet son interaction avec CXCR4 ou CCR5, appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G hétéro-trimèriques (RCPG) et des changements structuraux de la sous-unité trans-membranaire de l'Env qui coïncident avec la fusion des membranes et l'internalisation de la capside virale dans la cellule hôte. Certains microdomaines lipidiques (rafts) composés de sphingolipides et cholestérol pourraient concentrer des effecteurs de la machinerie de transduction cellulaire et ainsi favoriser la formation d'un complexe VIH/récepteur. Pour explorer cette hypothèse nous avons délocalisé CD4 des " rafts "comme alternative aux méthodes biochimiques, " invasives " basées sur la déstructuration des microdomaines par déplétion de cholestérol. Nous avons identifié et muté les déterminants qui permettent à une fraction du récepteur de s'ancrer dans les rafts (i.e sites de palmitoylation de CD4 et d'interactions avec la Src kinase p56lck). La délocalisation massive de CD4 ainsi obtenue vers les phases désordonnées de la membrane où CCR5 réside bien qu'il soit naturellement palmitoylé , nous a permis de conclure que le processus de l'entré virale n' est nullement dépendant de la distribution de CD4 dans les rafts, mais requièrt en revanche la présence de cholestérol . Ce prérequis peut s'expliquer par l'action structurante du cholestérol sur la conformation du co-récepteur et sa capacité à lier l'Env qui détermine à son tour l'activation du mécanisme de fusion des membranes virales et cellulaires.

Nos objectifs sont d'étudier par des approches dynamiques le regroupement des récepteurs viraux et leur distribution membranaires. A cette fin, nous avons mis en œuvre avec un groupe de biophysiciens des membranes (A. Lopez, IPBS, Toulouse) des méthodologies quantitatives adaptées aux études sur cellules vivantes. Nous avons réalisé des chimères des récepteurs du VIH avec des dérivés de la protéine fluorescente GFP que nous avons validé au plan fonctionnel et qui nous permettent d'appréhender le transfert d'énergie entre deux fluorophores ayant les propriétés spectrales requises (FRET) (transfert d'énergie intermoléculaire par résonance de fluorescence).

Caractérisation des relations structures/conformation/fonctions des récepteurs CCR5 et CXCR4. L'équipe a montré l'existence à la membrane plasmatique de plusieurs états conformationnels actifs de CCR5, selon que le récepteur n'est pas associé aux protéines G, ou au contraire quand il est couplé de manière constitutive à celles-ci. Il pourrait en resulter un  gain  de fonction pour certaines des activités biologiques de ce récepteur dans des conditions physiologiques normales ou dans l'infection VIH. D'autre part, notre expérience acquise dans ce domaine de recherche est au service de la caractérisation des dysfonctionnements de CXCR4 associés au syndrome de WHIM . Le couple CXCR4/SDF-1 qui interagit dans un partenariat réciproquement exclusif occupe une place unique dans la famille des chimiokines et de leurs récepteurs par son rôle dans l'embryogenèse, l'organogenèse et durant la vie adulte dans le trafic des lymphocytes, des granulocytes et des précurseurs hématopoïètiques CD34+. Le syndrome WHIM est un déficit immunitaire rare à transmission autosomale dominante, qui se caractérise par des verrues liées à des infections récurrentes par papillomavirus (HPV) (W, "Warts"), une hypogammaglobulinémie (H), des infections bactériennes à répétition (I), et par une rétention pathologique de neutrophiles matures dans la moelle osseuse (M, "Myélokathexis"). Son association récente à des mutations hétérozygotes localisées dans le gène cxcr4 qui provoquent des troncations de la région intracellulaire C-terminale (C-ter) du récepteur nous a conduit à rechercher des anomalies fonctionnelles de l'axe SDF-1/CXCR4. Nous avons identifié une nouvelle mutation dans le gène cxcr4 invalidant les 15 derniers résidus du C-ter chez des sujets adultes d'une même famille. Le récepteur muté devient réfractaire aux processus d'internalisation et de désensibilisation homologue ce qui se traduit par une réponse cellulaire aux agonistes anormalement intense et persistante. Dans une seconde famille de patients ne présentant pas d'anomalie du gène cxcr4, nous avons montré les mêmes défauts spécifiques de CXCR4 indiquant que les différentes formes du syndrome WHIM partagent en dépit de leur hétérogénéité génétique des mécanismes pathogéniques communs liés aux dysfonctions (gain de fonction) de l'axe SDF-1/CXCR4. Des approches génétiques et biochimiques sont actuellement mise en œuvre pour identifier l'anomalie sélective de la signalisation à travers CXCR4.

Réversion d'un vaccin vivant atténué SIV délété dans le gène nef . (Lisa Chakrabarti) (collaboration Cecilia Cheng-Meyer et al, Aaron-Diamond)

Le gène nef est un déterminant essentiel du pouvoir pathogène des virus du SIDA. Le virus de l'immunodéficience simienne délété dans le gène nef (SIVmac239Δnef) cause une infection atténuée, avec une faible charge virale, et a de ce fait été considéré comme un candidat potentiel pour un vaccin vivant atténué. Cependant, certains macaques rhésus inoculés avec ce virus atténué montrent une déplétion progressive des lymphocytes T CD4+ et progressent vers la maladie. Nous avons étudié un de ces cas de réversion spontanée et montré que le virus révertant avait acquis une seconde délétion dans le gène nef, qui avait pour conséquence de restaurer le cadre de lecture originel de nef. La protéine résultante, Nef-Δ2, est défective pour de multiples fonctions telles que la capacité d'induire l'internalisation des molécules CD4 et CMH-I. Cependant, Nef-Δ2 a retrouvé la capacité d'augmenter la réplication du virus dans les lymphocytes T non stimulés. Ces résultats suggèrent que la protéine révertante conserve la capacité d'activer les cellules cibles du virus, et de favoriser de ce fait la réplication virale. Ces travaux montrent qu'une protéine nef tronquée peut malgré tout contribuer à la pathogénèse et soulignent les risques potentiels associés aux vaccins vivants atténués contre le SIDA..

Méchanismes moléculaires de l'induction du déficit immunitaire par l'infection VIH : Effet agoniste de la glycoprotéine d'enveloppe du VIH sur CXCR4. (Lisa Chakrabarti, Julie Harriague, Karl Balabanian, Christine Décrion).

Nous posons la question du rôle des glycoprotéines d'enveloppe (Env) du VIH dans la perte de fonction et la destruction des lymphocytes T CD4 au cours du SIDA. Au cours du processus d'entrée virale, la glycoprotéine de surface gp120 interagit avec son récepteur CD4 et son corécepteur CXCR4 ou CCR5, dans une série d'étapes qui mènent à un changement conformationnel majeur de la glycoprotéine transmembranaire gp41 et à la fusion des membranes virales et cellulaires. Or, l'antigène CD4 et les chimiorécepteurs CXCR4 et CCR5 sont également des molécules clefs de la réponse immune, de par leur rôle dans l'activation et la migration lymphocytaire. La gp120 présente à la surface des particules virales et à la surface des cellules infectées est susceptible de générer des signaux via CD4 et les corécepteurs, et peut donc contribuer à l'activation anormale des lymphocytes T CD4+, qui est une caractéristique majeure de la pathogénèse du SIDA. Nous avons entrepris une caractérisation systématique des voies de signalisation perturbées par Env dans les lymphocytes T CD4+ (LT4) primaires, qui sont les cibles principales du VIH.

Nous avons observé que la gp120, un ligand viral de CXCR4, reproduit les effets de la chimiokine SDF-1, le ligand naturel de CXCR4. Les tests de migration en chambre de "transwell" montrent que la protéine recombinante gp120LAI induit la chimiotaxie des LT4 primaires, processus qui est inhibé en présence d'AMD3100, un antagoniste synthétique spécifique de CXCR4. La gp120 présente à forte concentration locale serait donc susceptible d'attirer, voire de retenir les cellules cibles du VIH. Les voies de signalisation activées par la gp120 recoupent celles mises en jeu par la chimiokine SDF-1, à savoir mobilisation du calcium intracellulaire, activation de la PI3-kinase, induction d'une polymérisation de l'actine, endocytose de CXCR4 et activation des MAP kinases Erk 1/2. Cependant, la cinétique de décroissance du signal dans les tests de flux calciques est plus lente pour la gp120 que pour SDF-1, ce qui laisse présager d'une différence dans les mécanismes de désensibilisation des réponses à ces deux ligands. Ces données mènent à la notion d'un effet agoniste de la gp120 via CXCR4, qui diffère toutefois de celui induit par SDF-1, d'où possibilité d'une signalisation "anormale". Ces recherches s'inscrivent dans le contexte du GPH (Grand Programme Horizontal) SIDA développé à l'Institut Pasteur, plus spécifiquement dans le sous-programme #2 du GPH qui a pour objectif d'analyser les mécanismes de dysfonctionnement des LT4 dans le SIDA..

Nous explorons également les effets signalisateurs de l'enveloppe du VIH dans le contexte des interactions entre cellules présentatrices de l'antigène et lymphocytes T CD4+. L'étude de la relocalisation des antigènes viraux et des molécules signalisatrices est effectuée par imagerie dynamique, en collaboration avec Spencer Shorte (Plateforme d'Imagerie Dynamique)

Réponse transcriptionelle (en puces cADN) des lymphocytes T à la stimulation par le VIH et la chimiokine SDF-1α. (Eric Cabannes , Lysiane Laurent, Fernando Arenzana) (collaborations: M.Parmentier, ULB, Bruxelles ; X.Gidrol, genopole du CEA, Evry ; J-Y Coppée, plateforme 2, I. Pasteur)

Avant d'aborder la problématique de ce projet de recherche, il était impératif de se doter des outils nécessaires à notre étude et de résoudre les difficultés techniques inhérentes à toute nouvelle biotechnologie encore en développement. Ce constat a donc orienté nos travaux vers trois axes :

1)Compléter les banques de clones disponibles au CEA avec des gènes leucocytaires ; la spécificité d'expression tissulaire de ces derniers, responsable de leur sous-représentation dans les collections en question, rend cet enrichissement nécessaire.

2) Développer et valider un protocole expérimental robuste et reproductible, et l'analyse statistique correspondante (collaboration: J.-J. Daudin, Biostatistique et Génome à INA P-G).

3) Transposer et adapter ce protocole aux exigences matérielles et techniques imposées par l'utilisation de cellules primaires lymphocytaires CD4+, un modèle biologique plus pertinent, pour l'analyse de la dérégulation des programmes d'expression génique au cours de l'infection VIH.

Nous avons à ce jour, complété ces trois objectifs prioritaires et initié l'analyse du transcriptome de cellules T CD4+ lymphoïdes (lignée MT-4) infectées par le VIH. A l'issue de l'analyse statistique des données, nous venons d'obtenir les listes des gènes différentiellement exprimés dans les cellules primaires CD4+ suite à la stimulation par le VIH et la chimiokine SDF-1. Après validation expérimentale de certains d'entre eux, nous établirons une classification de ceux-ci en groupes fonctionnels (étape de clustering).

Caractérisation d'un récepteur pour le virus de la dengue sur les cellules dendritiques humaines. (Fernando Arenzana, Ralf Altmeyer, Ali Amara) (collaboration : Philippe Desprès et al, I.Pasteur ) (EMBO R.,4, 7, 723-728-2003)

Le virus de la dengue (DV), un flavivirus transmis par le moustique et qui cause de grandes épidémies et des formes hémorragiques graves, infecte essentiellement les cellules dendritiques immatures. Nous avons montré que le récepteur lectinique DC-SIGN, un récepteur membranaire spécifique des glycoprotéines mannosidées, lie les enveloppes de DV dérivés de cellules de moustique et permet l'infection de cellules dendritiques humaines dérivées des monocytes circulants. La démonstration du rôle sine qua non de l'expression membranaire pour l'infection DV a été permise par le blocage de l'infection en utilisant des anticorps anti DC-SIGN ou une forme soluble (ectodomaine tétramérique) du récepteur. Inversement, l'expression transduite de DC-SIGN dans de nombreux types de cellules non-permissives induit une totale permissivité à l'infection et à la réplication du virus DV. L'efficacité de l'interaction enveloppe DV/DC-SIGN pour l'infection dépend de l'intensité de la mannosidation de l'enveloppe, ce qui permet d'expliquer pourquoi des souches de DV différentes montrent des efficacités d'infection variable. Outre qu'ils apportent la caractérisation, longtemps recherchée, d'un récepteur majeur pour le virus de la dengue, nos résultats permettent de disséquer une stratégie fascinante de ce virus, consistant à obtenir de son hôte intermédiaire (moustique) la mannosidation de son enveloppe, nécessaire à l'infection des cellules dendritiques de son hôte humain définitif, et à sa dissémination chez celui-ci .

La coordination de l'ensemble de ces résultats a été faite conjointement par Fernando Arenzana et Jean-Louis Virelizier

Légende:

Dissémination du virus du SIDA de cellule à cellule: relocalisation du virus VIH (points verts, particules Vpr-GFP) à la synapse immunologique (zone jaune) formée entre une lymphocyte CD4+ (en rouge, marquage CD3) et une cellule dendritique (en bleu sombre).

Mots-clés: VIH, sida, dengue, récepteurs, dendritiques, signaux



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Goupil Marie-Laure (goupil@pasteur.fr) Amara Ali , INSERM (CR, aamara@pasteur.fr)

Altmeyer, Ralf, Institut Pasteur (CR, altmeyer@hkucc.hku.hk)

Arenzana-Seisdedos, Fernando, INSERM (DR1, farenzan@pasteur.fr)

Bachelerie, Françoise, INSERM (CR1, fbachele@pasteur.fr)

Chakrabarti, Lisa, Institut Pasteur (CR, chakra@pasteur.fr)

Virelizier, Jean-Louis, Institut Pasteur(Pr), INSERM (DRE) (virelizi@pasteur.fr)
Balabanian, Karl, stage post-doctoral, kbalaban@pasteur.fr

Harriague, Julie, stage post-doctoral,harriag@mailhost.pasteur.fr

Cabannes, Eric, stage post-doctoral, cabannes@pasteur.fr

Lagane, Bernard, stage post-doctoral, lagane@pasteur.fr

Lozach, Pierre-Yves, Etudiant en thèse, lozach@pasteur.fr

Décrion, Christine ,Etudiant DEA , cdecrion@pasteur.fr
Laurent, Lysiane (technicienne IP) (lyslaure@pasteur.fr)

Planchenault, Thierry,(Ingénieur IP), tplanche@pasteur.fr)

Staropoli, Isabelle, (Ingénieur IP), ( istaro@pasteur.fr)

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