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     Immunologie Moléculaire des Parasites - CNRS URA 1960


  Responsable : PUIJALON Odile (omp@pasteur.fr)


  resume

 

La thématique centrale de l'Unité est l'étude des facteurs qui déterminent l'issue d'une infection palustre, dans le but de mettre au point un vaccin. Deux grands axes sont poursuivis. Le premier concerne des recherches fondamentales sur la pathologie consécutive à l'infection par P.falciparum chez l'homme et dans le modèle expérimental du singe S. sciureus. Il comprend l'exploration de l'activité des cellules immunocompétentes au cours de l'accès pernicieux ou non compliqué, l'exploration du rôle de la rate dans un modèle d'organe perfusé, la recherche de facteurs parasitaires de virulence et une étude de la diversité parasitaire en zone d'endémie et de ses conséquences biologiques. Le second axe concerne le développement de vaccin ciblant des molécules de surface conservées identifiées comme cibles potentielles de la réponse protectrice acquise en zone d'endémie.



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L'objectif à long terme de nos recherches est le développement de vaccins prévenant la mortalité et la morbidité palustre. Les recherches sont centrées sur des programmes complémentaires, incluant d'une part une analyse intégrée des interactions hôte/parasite qui conditionnent la physiopathologie du paludisme et d'autre part, le développement de vaccins. L'analyse coordonnée des éléments contribuant à la pathologie palustre se déroule selon quatre axes.comprend quatre volets. Le premier concerne une étude de l'activation du système immunitaire dans différentes formes cliniques du paludisme à P. falciparum, avec le souci de mieux cerner la contribution des cellules T dans l'équilibre entre pathologie et protection pour ensuite identifier les molécules parasitaires en cause. Le second axe volet concerne la caractérisation de facteurs parasitaires de virulence, par une approche de génétique réverse et une analyse systématique du transcriptome parasitaire dans différentes conditions physiologiques. Le troisième axe volet concerne l'analyse du rôle da la rate dans l'infection palustre, et en particulier son implication dans la clairance parasitaire et dans la modulation de l'expression d'antigènes de surface chez le parasite. Le quatrième axe est une étude moléculaire de la diversité des populations parasitaires circulant en zone d'endémie et de ses conséquences sur la survenue des accès, leur gravité et les réponses immunes. Le développement de vaccins cible des antigènes conservés de P. falciparum et de P. vivax exprimés au stade sanguin, et identifiés comme cibles de mécanismes effecteurs de la clairance parasitaire.

Une des caractéristiques de l'Unité est de privilégier les études in vivo, aussi bien chez l'homme que chez le singe. Ceci implique le recours à des modèles expérimentaux d'infection ainsi qu'à des collaborations sur le terrain : études d'épidémiologie moléculaire dans le cadre des Instituts Pasteur du Réseau International  et du réseau européen Resmalchip ; études de cas hospitaliers au Ghana ; étude de modèles expérimentaux chez le singe en Guyane et au Sri Lanka.

1. Rôle de l'activation immune dans la physiopathologie du paludisme (C.Behr, S. Loizon, P.Boeuf, F. Remerand, I. Vigan, J.C.Michel).

Les formes graves du paludisme sont caractérisées par une inflammation systémique profonde associée à une accumulation locale des globules rouges parasités dans les organes profonds. L'inflammation systémique est un facteur de mauvais pronostic du fait des complications secondaires qu'elle engendre. La cascade des évènements immunologiques qui conduit au paludisme simple ou compliqué est encore très mal connue, mais de nombreux éléments suggèrent qu'elle ne serait pas la même dans les différentes formes cliniques.

En collaboration avec l'hôpital Korle-Bu (Dr. Goka) et l'Institut Noguchi au Ghana (Dr Akanmori) et le Rigshospitalet au Danemark (Dr. Hviid et Dr.Kurtzhals), nous avons entrepris une analyse détaillée des profils d'activation des lymphocytes T et des monocytes chez des enfants souffrant de paludisme simple, d'anémie grave ou de neuropaludisme. Nos résultats indiquent que la principale différence entre les deux formes graves se situe au niveau des lymphocytes T. En utilisant une technique RT-PCR en temps réel que nous avons développée et qui permet la quantification absolue des messagers de cytokines, nous poursuivons cette analyse. En parallèle, nous étudions le statut phénotypique et fonctionnel des monocytes et des cellules dendritiques chez ces enfants.

Les lymphocytes T gamma delta semblent intervenir très précocement dans la régulation de l'immunité innée. Leur rôle est étudié dans le modèle d'infection par P. falciparum chez un hôte expérimental, le singe Saimiri sciureus, grâce aux outils d'exploration des réponses des cellules immunocompétentes que nous avons récemment développés pour cet animal. Nos résultats indiquent que les lymphocytes T V gamma  interviendraient dans la phase de clairance des parasites. Nous étudions actuellement le rôle fonctionnel de ces lymphocytes in vitro et in vivo.

2. Facteurs parasitaires de pathogénicité (S. Bonnefoy, P.Buffet, P.David, I.Delrieu, M.Diez Silva, M Guillotte, O. Natalang).

Nous utilisons une approche de manipulation génétique de Plasmodium falciparum dans l'étude de la virulence dans le modèle d'infection expérimentale du singe Saïmiri sciureus. Les souches plasmodiales qui induisent une infection létale présentent des caractéristiques particulières, parmi lesquelles une délétion du gène resa et la présence d'un allèle particulier du locus hrp1. Ces deux gènes codent pour des protéines localisées dans la membrane des hématies infectées et interagissent avec d'autres protéines parasitaires et le cytosquelette érythrocytaire. Pour analyser la contribution de ces facteurs à la pathologie palustre, nous avons procédé dans un premier temps à l'invalidation du gène resa de la souche avirulente FUP/CB. La perte d'expression de la protéine correspondante, sans effet notable sur la croissance parasitaire in vitro, entraîne cependant une modification du profil d'infection in vivo en augmentant la parasitémie moyenne chez tous les singes infectés. La mise au point des outils génétiques nécessaires à la mutagenèse séquentielle, est actuellement mise à profit pour l'étude de la contribution du gène hrpI à la pathologie. D'autres outils moléculaires, tels que des systèmes de sélection positive/négative sont en cours de développement au laboratoire.

Nous étudions le rôle de l'adhésine var O exposée à la surface du globule rouge parasité qui permet à celui-ci de fixer des hématies saines (" rosetting ") ou parasitées (auto-agglutination) et du facteur RESA inséré par le parasite dans la membrane du globule rouge.

L'Adhésine var O est composée de 6 domaines d'adhésion distincts. Nous avons entrepris de cloner et d'exprimer les différents domaines sous forme de protéine recombinante en collaboration avec l' Unité d'Immunologie Sructurale (G. Bentley) et le laboratoire de D. Arnot (Université d'Edinburgh), afin d'identifier les domaines impliqués dans le rosetting et l'auto-agglutination, les récepteurs cellulaires impliqués, et d'explorer la faisabilité d 'une approche vaccinale ciblant des interactions dans le modèle d'infection chez le singe Saimiri. L'analyse des propriétés immunologiques de ces domaines est en cours.

Le facteur RESA a été identifié dans le modèle d'infection chez le singe comme associé à la virulence de P.falciparum. En collaboration avec le Monash Institute en Australie et l'Institut Pasteur de la Guyane Française, nous utilisons une approche de génétique réverse pour explorer la contribution de RESA à la virulence dans ce modèle. Nous avons procédé à l'invalidation du gène resa de la souche avirulente FUP/CB. La perte d'expression de la protéine correspondante, sans effet notable sur la croissance parasitaire in vitro, entraîne cependant une modification du profil d'infection in vivo avec une augmentation de la parasitémie moyenne chez tous les singes infectés. L'étude rhéologique et fonctionnelle des érythrocytes infectés par les parasites mutants montre que la protéine RESA n'est impliquée ni dans la rigidité membranaire ni dans le phénomène de cytoadhérence qui contribue à la pathologie, invalidant ainsi certaines hypothèses portant sur les fonctions potentielles de cette protéine.

Les contraintes liées à la faible efficacité de transfection nous ont amenés, en parallèle au développement des outils de manipulation génétique développés dans le cadre d'un PTR coordonné par Serge Bonnefoy, à élaborer une stratégie alternative: l'exploration du transcriptome. En collaboration avec la Génopole (PT2, J-Y Coppée), une plate-forme d'exploration du transcriptome de P.falciparum par puces à ADN a été mise en place. L'étude de parasites provenant de patients infectés par P.falciparum, effectuée dans le cadre d'un programme de recherche clinique, mené avec le Centre Médical de l'Institut Pasteur et les services d'urgence de plusieurs hôpitaux parisiens, devrait permettre d'identifier les gènes spécifiquement activés in vivo. Ceux-ci pourraient contribuer à la virulence et à une meilleure adaptation des parasites à leur hôte. En parallèle à cette utilisation des puces à ADN dans l'étude des facteurs de pathogénicité, nous coordonnons l'exploitation de cette plate-forme dans le cadre des projets de recherche de 15 laboratoires français travaillant sur différents aspects de la biologie de P.falciparum.

3. Recours à un système d'organe isolé-perfusé pour explorer la fonction de la rate au cours de l'infection par P.falciparum (P.Buffet, P.David).

La rate joue un rôle majeur au cours de l'infection palustre, aussi bien dans l'élimination du parasite que dans la modulation du phénotype parasitaire. Nous avons entrepris un programme de recherche dont le but est d'explorer chez l'homme les fonctions spléniques en début d'infection, à un stade où elles pourraient conditionner l'orientation clinique. Le premier objectif a été de mettre en place un système d'organe isolé-perfusé permettant une survie de plusieurs heures de la rate ex vivo. Une étude péliminaire sur dix rates de porc ayant montré la faisabilité de ce projet, le système de préfusion ex vivo est à présent appliqué à des rates humaines prélevées chez des patients dans le cadre d'interventions sur des néoplasies gastriques ou pancréatiques. Ces rates sont perfusées avec des érythrocytes infectés par P.falciparum, ceci permettant d'effectuer diverses explorations fonctionnelles et immuno-histochimiques.

4. Etude de la diversité parasitaire et de ses conséquences sur la réponse immuneen zone d'endémie (O.Puijalon, H. JouinM-T Ekala, N. Noranate, M. Guillotte).

L'analyse des populations parasitaires dans diverses conditions de transmission et de leur évolution dans le temps est nécessaire à l'élaboration de stratégies de lutte rationnelles. Nous avons récemment mis en place un programme d'analyse du polymorphisme parasitaire par séquençage systématique. Nous avons étudié l'évolution temporelle sur dix ans des populations parasitaires circulant dans le village de Dielmo au Sénégal. Nous avons procédé à l'analyse de la diversité allélique des gènes Pfcrt, Pfdhfr et du locus msp1 bloc 2. Nous avons en parallèle développé de nouvelles stratégies de typage d'isolats de terrain à l'aide d'une batterie de marqueurs microsatellites neutres. Les conséquences du polymorphisme allélique du domaine MSP-1 bloc 2 sur les réponses immunes ont été étudiées dans deux villages sénégalais. Nous avons montré que la présence d'anticorps contre ce domaine au début de la saison de transmission est associée à une diminution du risque d'accès clinique. Cette association est paradoxale, puisque l'on observe des profils de réactivité figés, indépendants des génotypes parasitaires présents ou passés. Contrairement à ce qui est décrit pour l'antigène variant PfEMP1, il n'y a pas accumulation de nouvelles spécificités anti-msp1 bloc 2 à la suite de l'exposition à un nombre croissant d'allèles. L'exposition à de nouvelles souches lors d'un accès s'accompagne parfois d'une réponse de très courte durée qui revient rapidement au profil "figé", propre à chaque individu. Une réponse spécificité inappropriée ou non optimale contre les souches surinfectantes suggère un nouveau mécanisme d'évasion des parasites au système immunitaire, qui favorise une clairance partielle incomplète et un portage chronique.

En collaboration avec l'Institut Pasteur de la Guyane, nous avons étudié les réponses immunes contre des variants antigéniques dans le modèle d'infection expérimentale du singe Saimiri. Ceci a mis en évidence qu'il n'existe pas de relation directe entre la réponse contre l'antigène variant et la protection.

En collaboration avec T. Fandeur (I.P. Cambodge), F. Ariey et M. Randrianarivelojosia (I.P. Madagascar), R. Jambou (I.P. Dakar) et E. Legrand (I.P. Guyane), nous étudions au sein d'un programme multicentrique la diversité allélique des populations parasitaires dans quatre zones géographiques distinctes. Ce programme a permis de décrire un nombre important de nouvelles mutations dans des loci cibles des anti-paludiques et un nombre très élevé d' allèles du locus msp1 bloc2.

5. Le programme de développement vaccinal est centré sur des antigènes de stades érythrocytaires identifiés comme cibles de certains effecteurs de la réponse immune protectrice.

Protéines de surface du mérozoïte (S.Longacre, S. Bonnet, H.Polson, S. Rosario).

Le groupe de S. Longacre développe un programme de recherche explorant la région C-terminale conservée de l'antigène de surface du mérozoïte, MSP1p19 de P.falciparum et de P.vivax, exprimée sous forme de protéine recombinante dans le système baculovirus / cellules d'insecte. L'efficacité et l'immunogénicité de différentes formulations de l'antigène MSP1p19, incluant plusieurs adjuvants expérimentaux, ont été évaluées chez la souris et les macaques (singes toque et rhésus). Plusieurs essais vaccinaux ont montré que MSP-1p19 était très immunogène et induisait une protection puissante et de longue durée, contre des souches homologues et hétérologues. L'état d'avancement des recherches sur MSP-1p19 est tel que des essais de vaccination de phase 1 sont en cours de mise en place sous l'égide de l'Institut Pasteur.

R23 : (O. Puijalon, M.Huynh Quan Dat, A Schneider, M. Guillotte).

L'antigène R23 est la cible d'anticorps opsonisant les érythrocytes infectés par P.falciparum. L'immunisation de singes Saimiri avec une dose minimale de cet antigène en Alum peut induire une protection efficace. Nous étudions en quoi la spécificité fine des anticorps induits chez la souris, le rat, le singe par l'immunisation avec l'antigène R23 influence la reconnaissance de la surface du globule rouge infecté, et poursuivons des recherches pour optimiser l'immunogénicité de ce candidat.

Mots-clés: Paludisme, Pathologie, Diversité, Vaccin, Génétique Moléculaire



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  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  LECUILLER Frédérique (flecuil@pasteur.fr) BEHR Charlotte, C.R.1, CNRS, (charlotte.behr@pasteur.fr)

BONNEFOY Serge, C.R., IP, (sbf@pasteur.fr)

BUFFET Pierre, C.R., IP, (pabuffet@pasteur.fr) (temps partiel 50%)

DAVID Peter, D.R.2, CNRS (pdavid@pasteur.fr)

LONGACRE Shirley, D.R.2, CNRS (longacre@pasteur.fr)

MICHEL Jean-Claude, C.L., Réseau IP, (jcmichel@pasteur.fr)

PUIJALON Odile, Chef d’Unité, C.L., IP (omp@pasteur.fr)

BOEUF Philippe, Stagiaire étudiant (thèse)

BONNET Sarah, Chercheur post-doctoral (CDD, IP)

DIEZ SILVA Monica, Stagiaire étudiante (thèse)

DELRIEU Isabelle, Chercheur post-doctoral (CDD, IP) (départ mars 2004)

EKALA Marie-Thérèse, Chercheur post-doctoral (CDD, IP)

NATALANG Onguma, Stagiaire étudiante (thèse) (départ mai 2004)

NORANATE Nitchakarn, Stagiaire étudiante (thèse) (arrivée novembre 2003, départ décembre 2003)

POLSON Hannah, Chercheur post-doctoral (CDD, IP)

REMERAND Francis, Stagiaire étudiant (thèse) (temps partiel 25%)

SCHNEIDER Achim, Chercheur post-doctoral (CDD, IP) (départ décembre 2003)

VIGAN Inès, Chercheur post-doctoral (INCO-DC)

GUILLOTTE Micheline, Technicienne, IP (mguillot@pasteur.fr)

HUYNH QUAN DAT Myoura, Technicienne, IP (dat@pasteur.fr)

JOUIN Hélène, Ingénieur, IP (hajouin@pasteur.fr) (temps partiel 20%)

JUBLOT Delphine, Technicienne, IP (djublot@pasteur.fr) (arrivée février 03, départ août 03)

LOIZON Séverine, Ingénieur, CNRS (sloizon@pasteur.fr)

ROSARIO Sandrine, Technicienne, IP (sdsantos@pasteur.fr)


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