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     Immuno-Hématologie et d'Immunopathologie


  Responsable : Guillaume DIGHIERO (dighiero@pasteur.fr)


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Les travaux de l'Unité ont été consacrés à : 1) l'étude du pronostic de la LLC en associant le profil mutationnel des gènes des immunoglobulines (Ig) aux systèmes d'évaluation pronostique connus; 2) l'étude des mécanismes à l'origine de la sous-expression du récepteur B et des défauts fonctionnels de celui-ci; 3) l'étude de l'expression de l'AID (activation induced cytidine deaminase) ; 4) l'étude des profils d'expression génique par la technique des puces à ADN



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Introduction

La leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B) est la forme la plus fréquente de leucémie dans les pays occidentaux. Elle est considérée comme une maladie correspondant à l'accumulation lente et progressive de lymphocytes B petits et matures ayant une origine clonale commune et dont la survie est prolongée par un défaut d'apoptose. Les cellules B de LLC présentent un phénotype caractéristique défini par l'expression de faibles taux du récepteur pour l'antigène (BCR) et l'expression constante de CD5 et CD23.

C'est une maladie tumorale avec une évolution relativement lente, puisque la médiane de survie dépasse 7 ans. Certains patients ont une espérance de vie qui n'est pas modifiée par l'existence de l'hémopathie, ne sont pas traités et meurent de pathologies non associées. D'autres vont mourir dans des délais variables de complications liées à la maladie. Il est donc fondamental de disposer dès le diagnostic de critères qui permettent d'évaluer le risque individuel de progression afin de pouvoir proposer une stratégie thérapeutique.

1) Etude du pronostic de la LLC en associant le profil mutationnel des gènes des Ig aux systèmes d'évaluation pronostique connus (Y. Vasconcelos, P. Oppezzo, G. Dumas, G. Dighiero)

Dans les années 80, nous avons proposé avec J. L. Binet une classification basée sur la méthode de Cox, qui permettait de définir le pronostic de la maladie en trois groupes de bon, intermédiaire et mauvais pronostic en fonction de la masse tumorale et de la présence d'anémie ou thrombopénie. Les malades de bon pronostic (stade A) sont définis par une masse tumorale faible et absence d'anémie et de thrombopénie. Ce groupe inclut 2/3 des malades et a une médiane de survie supérieure à 10 ans. Le groupe de pronostic intermédiaire (stade B) est défini par une masse tumorale importante et absence d'anémie et thrombopénie, il inclut 27 % des malades et la médiane de survie est de 7 ans. Le groupe de mauvais pronostic (Stade C) est défini par la présence d'anémie et/ou de thrombopénie, quelle que soit la masse tumorale. Il inclut 8% des malades et la médiane de survie est de 5 ans.

Si la classification anatomo-clinique que nous venons de décrire a réussi à très bien séparer trois groupes pronostiques, une étude que nous avons menée (Dighiero et col. , N. Engl. J. Med, 1998) a montré que les malades en stade A ont un pronostic qui est lui-même hétérogène, puisque environ la moitié des malades ne connaît aucune évolution au bout de dix ans, alors que l'autre moitié nécessite un traitement et qu'un fort pourcentage d'entre eux meurt de causes liées à la maladie. Comme la classification pronostique n'est pas capable de prévoir ces évolutions, il était important de chercher d'autres paramètres permettant d'anticiper cette évolution. Parmi ces facteurs l'étude du profil mutationnel des gènes des Ig s'avère le plus fiable.

Le lymphocyte B qui prolifère dans la LLC correspond phénotypiquement à une cellule B naïve, qui ne devrait pas avoir subi un processus de mutation somatique. Toutefois, avec Harry Schroeder, nous avons démontré qu'environ la moitié des malades présente un nombre considérable de mutations somatiques (Schroeder et Dighiero, 1994). Ceci nous a conduit à faire l'hypothèse que la cellule maligne impliquée dans cette maladie pourrait correspondre soit à une cellule vraiment naïve (n'étant pas passée par le centre germinatif) soit à une cellule mémoire étant au préalable passée par le centre germinatif. Plus récemment, un groupe anglais et un groupe américain ont confirmé notre hypothèse en démontrant que les LLC dont les cellules ne présentent pas de mutations somatiques correspondent à des formes plus indifférenciées et par conséquent plus malignes de la maladie.

Pour déterminer le rôle respectif de la classification pronostique et du profil mutationnel des Ig nous avons étudié 146 malades pour lesquels nous connaissions l'évolution et pour lesquels nous avons pu séquencer les gènes des Ig. Nos résultats ont montré qu'en additionnant ces deux paramètres on arrive à une définition pronostique beaucoup plus précise de la maladie et que la classification anatomo-clinique et le profil mutationnel des Ig sont indépendants et complémentaires (Vasconcelos et col, J. Clin. Oncology, 2003).

2) Mécanismes à l'origine de la faible expression du récepteur pour l'antigène (BCR) dans la LLC (Responsables : B. Payelle-Brogard et F. Vuillier en collaboration avec C. Magnac et G. Dumas).

Contrairement aux autres hémopathies malignes du lymphocyte B mature, le clone tumoral de la LLC, exprime d'une façon caractéristique des faibles taux du BCR, qui est composé de l'Ig de membrane (Igm) complexée de façon non covalente avec deux hétérodimères CD79a/CD79b. Ceci se traduit par une anomalie dans la transduction du signal, définie par une réponse proliférative défectueuse, une phosphorylation des tyrosines et une mobilisation calcique anormales, lors de l'activation par la voie du BCR. Toutefois, les mécanismes à l'origine de cette sous-expression demeurent inconnus.

Nos résultats nous ont permis d'écarter l'existence d'un problème génétique, ou d'un problème au niveau de la transcription. Dans le cas du gène codant pour la molécule CD79b, l'ADN génomique ne présente pas d'anomalies structurales. D'autre part, les transcrits courts CD79b, provenant d'un épissage alternatif et ne possédant pas le domaine extra-cellulaire ne sont pas en quantité anormale par rapport aux individus sains. La sous-expression du BCR dans la LLC n'est donc pas imputable à des altérations génétiques ou transcriptionnelles (Payelle-Brogard et col, 1999).

Par contre, une anomalie post-transcriptionnelle, à savoir un défaut d'assemblage des différentes chaînes du BCR, a pu être montrée par marquage intra-cytoplasmique. Le défaut d'assemblage se traduit par une anomalie de transport du récepteur du Reticulum-Endoplasmique vers le Golgi, comme le démontrent les expériences de pulse-chase. Ainsi, la sous-expression du BCR dans les lymphocytes de LLC apparaît liée à une anomalie dans l'assemblage et le transport intracellulaire comme cela avait été rapporté dans un modèle de cellules B anergiques chez la souris. En utilisant la microscopie confocale, nous avons confirmé le blocage au niveau du RE, à travers des doubles marquages incluant les différentes molécules du BCR et la calnexine (Payelle-Brogard et col, 2002 et 2003). Les figures ci-dessous montrent qu'une co-localisation des molécules µ et CD79b existe dans les cellules B normales, alors que cette co-localisation n'est pas observée dans les cellules de LLC.

Comme nos résultats ont montré la présence d'anomalies dans le transport de l'IgM vers le Golgi et donc dans la maturation, par différentes étapes de glycosylation de cette molécule, nous nous attachons maintenant à mieux caractériser ces anomalies au niveau des autres composants du BCR (CD79a et CD79b).

Les anomalies d'expression du récepteur B pour l'antigène (BCR) dans la LLC et les anomalies touchant la transduction du signal et le trafic intra-cellulaire, nous amènent à explorer les mécanismes par lesquels les récepteurs membranaires sont recrutés dans la cellule B de LLC. Les radeaux lipidiques jouent un rôle clé dans le processus de transduction du signal à partir des récepteurs membranaires et particulièrement du BCR. Le contrôle de l'accès du BCR aux radeaux constitue une étape clé qui gouverne la poursuite des événements de signalisation au travers du BCR durant le développement et la différenciation dirigée par l'antigène. Ainsi, la composition de ces derniers constitue un élément essentiel pour assurer la signalisation dans le lymphocyte B. Nous proposons d'analyser pour la première fois la constitution protéique des radeaux lipidiques dans le lymphocyte B de LLC (étude statique) et leur réorganisation suite à des stimulations pouvant mimer l'interaction du lymphocyte B avec le micro-environnement (étude dynamique).

Une caractérisation de la composition des radeaux peut permettre de comprendre les mécanismes de régulation de l'association du BCR avec les radeaux durant le développement et la différenciation du lymphocyte B dans la LLC. Une meilleure compréhension de l'organisation des récepteurs immuns et du degré de stabilité du BCR dans les radeaux, peut apporter des éléments intéressants dans le sens où cette organisation peut être manipulée pour diriger une réponse immune dans un sens ou dans l'autre. Ce projet, à reçu l'aval scientifique et le financement de la Fondation contre la Leucémie.

2) Etude de l'expression de l'AID dans la LLC (Responsables : G. Dighiero avec P. Oppezzo et G. Dumas).

Des travaux récents ont montré que l'AID joue un rôle clé dans les processus de mutation somatique (MS) et commutation isotypique (CI) du lymphocyte B normal puisque: 1) des lignées murines dépourvues de cette enzyme et des malades exprimant des mutations somatiques au niveau du site actif de cette enzyme qui la rendent incompétente, se sont avérées incapables d'induire des MS et de procéder à la CI; 2) des lignées plasmocytaires obtenues à partir de souris dépourvues de l'AID s'avèrent aussi incapables de MS et CI, mais deviennent compétentes lorsque le gène de l'AID leur est transfecté; 3) l'induction du processus de CI est associée à l'induction de mutations dans la région dite de "pre-switch µ" et 4) l'AID est capable d'induire des mutations somatiques au niveau de l'ADN de Escherichia Coli.

Le mécanisme par lequel l'AID induit la MS et la CI n'est pas élucidé à ce jour. L'AID est structurellement proche de l'APOBEC, qui est la première "RNA editing enzyme" décrite chez les mammifères ce qui a conduit à proposer qu'elle pourrait agir en modifiant au niveau de l'ARN différents substrats de nucléases encore inconnues et qui joueraient un rôle essentiel dans la MS et la CI. Toutefois, des résultats récents montrent que l'AID pourrait agir directement au niveau de l'ADN par un mécanisme de déamination.

Dans un travail antérieur, nous avons démontré que dans la LLC on observait fréquemment l'expression simultanée dans un même lymphocyte B de transcrits mu, delta et gamma exprimant le domaine variable du clone tumoral. Nous avons étudié l'expression de l'AID dans des cellules de LLC, comparativement à celle de lymphocytes B normaux après stimulation par la voie CD40L (l'AID n'est pas exprimée constitutivement dans le lymphocyte normal). Nos résultats montrent que les lymphocytes B de LLC qui expriment constitutivement l'enzyme, ont un processus de CI actif caractérisé par l'expression simultanée dans la même cellule de transcrits mu, delta, gamma et parfois alpha. Ces cellules présentent au niveau de l'ADN de nombreuses mutations dans la région " pre-switch μ  ". Toutefois, malgré une expression constitutive importante de l'AID, elles ne présentent pas de MS au niveau du domaine VDJ des gènes de l'Ig. Pour mieux définir ce processus, nous avons stimulé par la voie CD40 ligand des lymphocytes B de LLC exprimant constitutivement l'AID et ceux de LLC ne l'exprimant pas, ainsi que des lymphocytes B normaux. Nous avons obtenu une surexpression de l'enzyme chez les malades l'exprimant constitutivement et une expression constante dans des les autres cas. L'expression de l'AID était associée à l'induction d'une CI et de mutations somatiques au niveau de la région " pre-switch µ ". Cependant nous n'avons pu mettre en évidence de mutations somatiques au niveau du domaine VDJ. Ces résultats favorisent l'idée que le processus de mutation somatique requiert la présence de facteurs autres associés à l'AID.

Ces résultats nous amènent à étudier: 1) les partenaires de l'AID dans la MS et leur mode d'action et 2) les raisons du blocage de l'AID pour les LLC exprimant des gènes Ig non mutés. Ceci sera exploré par la technique du " double hybride". L'AID sera clonée dans un premier vecteur d'expression. Dans un autre, nous clonerons une librairie d'ADN complémentaire de cellules B soit normales soit de LLC. Après transfection dans la levure, l'interaction de l'AID avec une autre protéine codée par les différentes librairies, sera détectée par un gène rapporteur. Les protéines ainsi sélectionnées seront ensuite identifiées, isolées et purifiées. Nous essaierons aussi d'exprimer l'AID dans sa forme native dans un système procaryote. Si tel est le cas, l'AID sera cristallisée dans le laboratoire de P. Alzari à l'Institut Pasteur. La co-cristallisation de l'AID et l'étude de son affinité (BIAcore) avec les possibles partenaires trouvés dans l'essai de double hybride seront effectuées.

3) Etude de l'expression génique dans la LLC (Responsables : G. Dighiero avec Yuri Vasconcelos, Pablo Oppezzo et Gérard Dumas, en collaboration avec Frédéric Davi (Hôpital Pitié-Salpêtrière), Florence Cymbalista (Hôtel-Dieu de Paris) et Xavier Troussard (CHU de Caen).

Le Groupe Coopératif Français pour l'étude de la LLC (GCF-LLC), auquel participent depuis plus de 25 ans plus de 40 centres en France, a mis en place trois grandes études thérapeutiques à long terme dans la LLC incluant plus de 3300 malades (>60 % du total des malades de la littérature inclus dans des essais randomisés). Les résultats de ces études ont permis des avancées considérables dans le traitement de la maladie. De plus, une sérothèque et une cellulothèque de ces malades sont disponibles et les données cliniques et biologiques sont enregistrées dans une base de données.

Comme le pronostic des malades exprimant des gènes d'Ig non-mutés est beaucoup plus grave, que celui des malades exprimant des gènes avec mutations somatiques, ces résultats ont conduit certains groupes à proposer que la LLC ne serait plus une maladie unique, mais deux maladies, selon le niveau mutationnel des gènes des Ig, que présentent les lymphocytes B malins.

Nous avons donc présenté au nom du Groupe Français pour l'étude de la LLC un projet qui a été sélectionné par la Ligue contre le Cancer dans le cadre de l'appel d'offres CIT2 (Carte d'Identité des Tumeurs), pour l'étude de l'expression génique dans les cancers. Nous avons comparé le profil d'expression génique des LLC exprimant des gènes d'Ig sans mutations somatiques à celui des LLC exprimant des gènes Ig avec mutations somatiques. Le pronostic très différent, associé à la présence ou pas de mutations somatiques a conduit à se poser la question de l'existence d'une même maladie ou de deux maladies différentes. Cette étude a été réalisée avec les puces Affymetrix, disponibles dans le cadre des appels d'offre du Ministère de la Recherche.

Nous avons entrepris d'étudier 18 malades (9 présentant des formes très stables de la maladie et exprimant des gènes d'Ig mutés et 9 formes agressives exprimant des gènes Ig non mutés). Nos résultats montrent que ces deux formes à pronostic très différent ont des profils d'expression génique différents. Une analyse supervisée a montré une expression différentielle de 85 gènes qui étaient surexprimés soit par les formes mutées soit par les formes non mutées. Fait important, une analyse non supervisée a permis de séparer pour la première fois les formes mutées et stables des formes non-mutées et agressives. Ces résultats ont été confirmés en employant des techniques de RT-PCR quantitative.

Comme le passage en routine de la séquence des gènes des Ig, est difficile, la recherche d'un marqueur qui pourrait prédire le statut mutationnel des gènes des Ig constitue une préoccupation importante. Ainsi, nous avons décidé de tirer avantage des résultats issus des puces d'ADN, pour chercher un marqueur qui permette de prédire l'état mutationnel des gènes des Ig. Nos études ont permis de montrer que l'expression à des taux importants de la lipoprotéine lipase (LPL) et de la tyrosine-kinase ZAP-70 était corrélée avec l'expression de gènes non mutés par la cellule tumorale, alors que l'expression accrue de la métalo-protéinase ADAM29 était corrélée avec l'expression de gènes d'Ig comportant de nombreuses mutations somatiques. Ainsi, l'étude de ces paramètres permet de prédire avec un niveau de certitude très acceptable l'état mutationnel des gènes d'Ig dans la LLC.

Mots-clés: Autoimmunité, Leucémie Lymphoïde Chronique, Immunopathologie



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