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     Génétique Moléculaire des Virus Respiratoires - URA 1966 CNRS


  Responsable : van der WERF Sylvie (svdwerf@pasteur.fr)


  resume

 

Les activités de l'unité sont centrées sur la génétique moléculaire des virus à ARN positif ou négatif (virus grippaux, coronavirus associé au SRAS, picornavirus, hépacivirus). Elles portent sur l'étude des mécanismes moléculaires de l'expression et de la réplication des génomes viraux et de leur emploi comme vecteurs d'expression, l'analyse des interactions fonctionnelles entre le virus et son hôte, l'épidémiologie moléculaire et l'étude de la variabilité des génomes viraux et le développement d'approches vaccinales et diagnostiques, notamment pour le SRAS-CoV.



  rapport

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I. "GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE DES VIRUS RESPIRATOIRES"

responsable Sylvie van der WERF

a) Génétique moléculaire des complexes de transcription/réplication des virus grippaux

(Nadia NAFFAKH, Bernadette CRESCENZO-CHAIGNE, Emmanuel DOS-SANTOS, Pierre DUARTE-RODRIGUES, Monika MARASESCU)

Ayant montré à l'aide d'un système de transcription/réplication transitoire que la nature de certains nucléotides et la stabilité de la structure secondaire des extrémités des segments d'ARN viral sont des déterminants importants pour la reconaissance type spécifique par le complexe polymérase, nous avons mis en évidence une plus grande spécificité du complexe polymérase du virus de type C que de type A vis-à-vis de ces déterminants. Afin de comprendre leur rôle au cours de la multiplication virale, nous avons entrepris d'étudier l'effet de mutations de ces déterminants après introduction par génétique inverse dans le contexte d'un virus infectieux.

Dans le but de compléter notre étude sur les déterminants de spécificité d'espèce par comparaison des complexes polymérase issus de virus grippaux d'origine humaine et d'origine aviaire dans le contexte de cellules aviaires versus cellules de mammifères, nous avons réalisé le clonage du promoteur polI aviaire. Cela permet d'envisager le développement de la génétique inverse pour les virus grippaux en cellules aviaires et l'étude des interactions fonctionnelles du complexe polymérase avec les protéines cellulaires en cellules aviaires. Dans la perspective d'identifier les interacteurs cellulaires du complexe, des virus grippaux exprimant une des sous-unités du complexe (PB2) sous forme taggée ont été obtenus, ce qui permet également le suivi de la localisation intracellulaire des complexes de réplication au cours du cycle viral.

b) Vecteurs viraux et vaccinologie

(Nicolas ESCRIOU, Benoît CALLENDRET, Bernadette CRESCENZO-CHAIGNE, Sylvie GERBAUD, India LECLERCQ, Valérie LORIN)

Immunisation génique à base d'ARN nu au moyen de réplicons recombinants

Ayant précédemment montré que des réplicons dérivés du virus Mengo (MV) permettant l'expression de la nucléoprotéine (NP) du virus grippal sont capables, après injection sous forme d'ARN nu à la souris, d'induire une immunité protectrice vis-à-vis d'une infection d'épreuve par le virus grippal, des réplicons recombinants dérivés du Mengo virus permettant l'expression de l'hemagglutinine sous forme glycosylée ont été obtenus. Nous avons entrepris de généraliser ces observations en démontrant la capacité de réplicons MV recombinants exprimant différentes séquences hétérologues (antigène HBs, NP du LCMV) à induire une immunité T-cytotoxique ou humorale éventuellement protectrice vis à vis d'une injection d'épreuve.

Virus grippaux transfectants à segment bicistronique

Par génétique inverse des virus grippaux transfectants à segment bicistronique comprenant un promoteur 3' interne ont été obtenus, et leur capacité à se multiplier in vivo et à induire une réponse humorale ou T-cytotoxique vis-à-vis d'antigènes hétérologues a été établie. Ces travaux ont permis d'identifier l'importance des séquences chevauchant la région codante pour la multiplication des virus à segment bicistronique suggérant leur rôle pour l'emballage des segments d'ARN viraux.

Nous avons entrepris de généraliser cette approche à l'expression d'autres séquences hétérologues (antigène HBs, NP du LCMV) ainsi qu'à d'autres segments du virus grippal.

Expression des protéines structurales du SRAS-CoV

Le séquençage complet du génome du SRAS-CoV a été réalisé directement à partir d'un prélèvement respiratoire d'un patient de l'hôpital français de Hanoi, Vietnam. Après clonage des séquences correspondant aux différentes protéines structurales, leur expression au moyen de différents vecteurs procaryotes et eucaryotes a été entreprise afin de produire les protéines recombinantes dans une perspective à visée vaccinale et/ou diagnostique.

c) Centre National de Référence du Virus Influenzae (Région Nord) et Centre collaborateur de l'OMS pour la référence et la recherche sur les virus grippaux et les autres virus respiratoires

(Sylvie van der WERF, Jean-Claude MANUGUERRA, Ana-Maria BURGUIERE, Maryse TARDY-PANIT, Saliha AZEBI, Aurélien BRIONNE, Patricia JEANNIN, Valérie LORIN, Claudine ROUSSEAUX)

Epidémiologie et évolution des virus grippaux

En tant que Centre de Référence, l'unité contribue à la surveillance des virus grippaux et d'autres virus respiratoires au niveau national par le biais du réseau de laboratoires hospitaliers RENAL et du réseau des GROG (Groupes Régionaux d'Observation de la Grippe), et au niveau international notamment européen, par échange télématique des données dans le cadre du groupe EISS (European Influenza Surveillance Scheme), et par l'animation du réseau EUROGROG. Par sa contribution à la Cellule d'Alerte et de Réponse aux Epidémies, le Centre a également participé à l'investigation de phénomènes épidémiques associés à une mortalité élevée en République Démocratique du Congo à l'invitation de l'OMS et d'ONG comme MSF.

L'isolement, l'identification, la caractérisation antigénique ainsi que la caractérisation génétique des virus respiratoires sont réalisés à partir des prélèvements de cas d'infections respiratoires de type syndrome grippal adressés au Centre. L'unité assure également la caractérisation antigénique et génétique des virus grippaux animaux isolés chez les porcs, les chevaux ou encore l'avifaune. Ces études par séquençage à large échelle devraient permettre l'analyse de l'évolution spatio-temporelle des virus grippaux humains et animaux (aviaires, équins, porcins) en relation avec la symptomatologie clinique et les caractéristiques phénotypiques des virus, ainsi que de la fréquence des réassortiments entre différents lignages de virus. L'analyse phénotypique et phylogénétique des virus grippaux de sous-type A(H1N2) qui a récemment émergé nous a permis de montrer que différents évènements de réassortiment indépendants sont à l'origine de ce nouveau sous-type.

Contribution à l'investigation de l'épidémie de Syndrome Respiratoire Aigu Sévère

A la demande de l'OMS, l'unité a fait partie du réseau de laboratoires de l'OMS chargés de la recherche de l'étiologie du SRAS. Ainsi, parallèlement à l'investigation avec l'aide de la CIBU des cas français probables ou possibles, l'unité a contribué à l'identification du nouveau coronavirus comme agent étiologique du SRAS, à l'analyse des profils d'excrétion du virus chez les patients et au développement et la validation de tests diagnostics par RT-PCR pour la détection de ce virus.

II. "VIRUS des HÉPATITES", Responsable: Annette MARTIN

Etude in vitro et in vivo de différentes étapes du cycle viral des virus de l'hépatite C et GBV-B

(Annette MARTIN, Lisette COHEN, David GHIBAUDO, Christophe CHEVALIER, Lucile WARTER)

L'étude du virus de l'hépatite C (VHC) est compliquée par l'absence de système cellulaire permettant la multiplication de ce virus in vitro et de modèle animal autre que le chimpanzé. Nous nous intéressons au virus GBV-B comme modèle d'étude du VHC. Sur le plan génomique, le GBV-B est le virus le plus proche du VHC; il est responsable d'une hépatite chez de petits primates du Nouveau Monde (tamarins, marmousets), et se multiplie ex vivo dans des cultures d'hépatocytes primaires de ces espèces, des propriétés qui soulignent l'intérêt de ce modèle.

Nous avons caractérisé le découpage protéolyique de la polyprotéine du GBV-B, notamment dans la région des protéines structurales. Dans le cadre de ces études, nous avons identifié une nouvelle protéine du GBV-B, qui présente des homologies partielles avec la protéine p7 du VHC, dont la fonction comme canal ionique a été récemment décrite mais dont le rôle dans le cycle viral est inconnu. Une étude fonctionnelle de cette nouvelle protéine du GBV-B permettra de clarifier le rôle de ces protéines dans le cycle infectieux de ces virus.

Nous mettons au point et utilisons des ARN autoréplicatifs (réplicons) du VHC et du GBV-B afin d'étudier les mécanismes moléculaires du découpage de la polyprotéine virale et de la réplication de l'ARN viral dans des lignées cellulaires d'origine hépatocytaire. Ces études renseignent également sur la possibilité de créer des clones moléculaires chimères du GBV-B pour lesquels des séquences fonctionnelles sont remplacées par les séquences équivalentes du VHC et dont l'infectivité est analysée chez le petit primate. Un premier virus GBV-B chimère porteur du domaine impliqué dans l'initiation de la traduction par entrée interne des ribosomes (IRES) du VHC a été obtenu. Il est précieux pour l'évaluation d'antiviraux ciblant la traduction du VHC dans ce modèle animal (coll. S.M. Lemon, U.T.M.B., Galveston, TX, USA; R.E. Lanford, S.F.B.R., San Antonio, TX, USA). De plus, l'analyse des mutations d'adaptation présentes dans le génome de ce virus chimère, qui lui conférent une capacité réplicative accrue, suggère l'existence d'interactions moléculaires au sein du génome qui semblent importantes dans la régulation de la réplication du GBV-B.

Mots-clés: grippe, hépatite C, picornavirus, replication, vaccin, vecteur, virologie, épidémiologie moléculaire, modèle animal



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  LAGANIER Sylvie, laganier@pasteur.fr COHEN Lisette, Université Paris 11, MC1, lisemc@pasteur.fr

ESCRIOU, Nicolas, Institut Pasteur, CR, escriou@pasteur.fr

LECLERCQ, India, Université Paris 7, MC, ileclerc@pasteur.fr

MARTIN Annette, Institut Pasteur, CR, annettem@pasteur.fr

MANUGUERRA Jean-Claude, Institut Pasteur, CR, jmanugu@pasteur.fr

NAFFAKH Nadia, CNRS, CR1, nnaffakh@pasteur.fr

van der WERF Sylvie,Université Paris 7, PR1 & Institut Pasteur, Chef de Laboratoire, svdwerf@pasteur.fr
CALLENDRET Benoît, Doctorant, benoitcl@pasteur.fr

CHEVALIER Christophe, Post-doctorant, chrische@pasteur.fr

DOS SANTOS Emmanuel, Doctorant, edsantos@pasteur.fr

DUARTE-RODRIGUES Pierre, Post-doctorant, pirod@pasteur.fr

GHIBAUDO David, Doctorant, ghibaudo@pasteur.fr

WARTER Lucile, Maîtrise, lwarter@pasteur.fr
BURGUIERE Ana-Maria, Pharmacien biologiste,amburgui@pasteur.fr

CRESCENZO-CHAIGNE Bernadette, Institut Pasteur, Ingénieur de Recherche

GERBAUD Sylvie, Institut Pasteur, Ingénieur de Recherche

TARDY-PANIT Maryse, Institut Pasteur, Ingénieur Technologue



AZEBI Saliha, Institut Pasteur, Technicienne CDD

BRIONNE Aurélien, Institut Pasteur, Technicien CDD

JEANNIN Patricia, Institut Pasteur, Technicienne CDD

LORIN Valérie, Institut Pasteur, Technicienne Supérieure

MARASCESCU Monika, Institut Pasteur, Technicienne

ROUSSEAUX Claudine, Institut Pasteur, Technicienne Supérieure



ANSELME-VATIN Alex, Institut Pasteur, Aide de Laboratoire

BLIN Josiane, Institut Pasteur, Aide de Laboratoire

FILLODEAU Anne-Marie, Institut Pasteur, Aide de Laboratoire

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