Nous étudions les aspects moléculaires de deux processus fondamentaux chez les bactéries : la localisation de protéines et la régulation transcriptionnelle. Nous nous intéressons plus particulièrement à la sécrétion de protéines extracellulaires, à l'assemblage d'appendices, à une famille de protéines extracytoplasmiques lipidées, aux lipoprotéines, et à la protéine MalT, le prototype d'une nouvelle famille d'activateurs transcriptionnels de haut poids moléculaire dépendant de l'ATP.

L'unité de Génétique moléculaire est composée de deux groupes. Chacun étudie des aspects moléculaires d'un processus fondamental chez les bactéries : la localisation de protéines et la biogenèse de l'enveloppe cellulaire (groupe Sécrétion) et la régulation transcriptionnelle (groupe Régulation).

Groupe " Sécrétion "

L'un des projets majeurs de cette équipe depuis 15 ans concerne la caractérisation des mécanismes de sécrétion d'une enzyme amylolytique, la pullulanase chez la bactérie à Gram-négatif, Klebsiella oxytoca. Tout récemment, nous nous sommes focalisés sur deux composants clés de cette machinerie de sécrétion, appelée le sécréton. Tout d'abord, la protéine qui constitue le composant majeur du canal par lequel la pullulanase traverse la membrane externe (PulD ou sécrétine), a été étudiée par des approches structurales et biochimiques. Douze sous-unités de cette protéine forment une structure qui ressemble à un tonneau entouré de 12 sous-unités d'un autre composant du sécréton, la protéine PulS. Cette dernière, aussi appelée pilotine, est responsable de la localisation de PulD dans la membrane externe. En collaboration avec l'équipe d'Andreas Engel à l'université de Bâle, nous avons résolu plusieurs problèmes techniques qui limitaient la résolution des images du complexe PulD-PulS obtenues en microscopie électronique (voir Figure 1). Nous espérons bientôt pouvoir repérer la pilotine dans la structure et identifier des domaines spécifiques de la sécrétine, et plus particulièrement comprendre quelle partie de la protéine est responsable de la fermeture du canal lorsqu'il n'est pas opérationnel.

Nous avons proposé que certains des 13 composants du sécréton forment une structure qui agit à la manière d'un piston pour propulser la pullulanase au travers de la sécrétine. Ce piston hypothétique est l'autre élément du sécréton qui retient notre attention. Lorsque le gène pulG, codant la sous-unité majeure de cette structure, est surexprimé, la protéine PulG est assemblée en longs pili sur la surface de la bactérie. Nous avons purifié ces pili ainsi que la protéine PulG. En combinant microscopie électronique et cristallographie aux rayons X, nous espérons pouvoir bientôt proposer un modèle de l'assemblage de ces structures (collaboration avec les équipes d'Andreas Engel à Bâle et Wolfram Welte à Constance).

Notre intérêt pour la biogenèse et la localisation des lipoprotéines a mûri en même temps que nos travaux sur la sécrétion de la pullulanase, elle-même une lipoprotéine. Les lipoprotéines bactériennes possèdent toutes une cystéine acylée en position 1 de leur polypeptide. Chez les bactéries à Gram-négatif, les lipoprotéines sont généralement localisées en deux endroits : la membrane interne ou la membrane externe, toujours face au périplasme. Nous avons montré, ainsi que d'autres équipes, que la localisation d'une lipoprotéine peut changer selon l'acide aminé en position 2. En ce moment, nous examinons la possibilité que cet acide aminé influence la nature et/ou le degré d'acylation de la cystéine en position 1 et ainsi, la capacité de la lipoprotéine à être transportée vers la membrane externe.

Groupe " Régulation "

Chez E. coli, le transport et le métabolisme de maltodextrines impliquent une série de protéines codées par des gènes situés en trois endroits distincts du chromosome et tous contrôlés par un activateur transcriptionnel spécifique, la protéine MalT, le représentant, de loin le mieux caractérisé, d'une nouvelle famille d'activateurs transcriptionnels que l'on retrouve des genres bactériens extrêmement éloignés.

MalT est constitué de quatre domaines structuraux : les trois premiers, spécifiques des protéines de la famille de MalT, semblent définir un nouveau module de transduction de signal, qui déterminerait, par sa capacité à s'oligomériser de manière contrôlée, l'aptitude du quatrième domaine à se fixer à l'ADN et à interagir avec l'ARN polymérase. Actuellement, nous explorons plusieurs aspects originaux du fonctionnement de cette protéine. Premièrement, la multiplicité des signaux qui contrôlent son activité soulève le problème de l'intégration ces signaux par la protéine en vue de fournir une réponse transcriptionnelle appropriée. En effet, MalT ne s'oligomérise qu'en présence d'ATP et de maltotriose (l'inducteur), mais l'activité de MalT est également contrôlée négativement par trois protéines MalK, MalY et Aes, qui répriment MalT, de façon indépendante en interférant avec la fixation du maltotriose. Deuxièmement, nous étudions l'hypothèse selon laquelle l'activité ATPase de MalT, très rare chez un activateur dépendant du facteur sigma majoritaire, pourrait être impliquée dans le contrôle de la compétition entre la fixation du maltotriose et les effecteurs négatifs. La dernière propriété originale de MalT qui nous intéresse est son mode de multimérisation, qui lui permet de reconnaître des arrangements de sites MalT extrêmement différents dans ses promoteurs cibles. Nos études mécanistiques de ces phénomènes mettent en jeu des approches génétiques et biochimiques ainsi que des approches structurales (obtention de cristaux de la protéine entière ou de différents sous-ensembles de domaines, cryomicroscopie électronique…).

Figure 1 : Structure aux rayons X d'un dimer de la protéine PulG. La présence de brins beta antiparallèles est une caractéristique de pilines de type IV (cliché de K. Shäffer et W. Welte, Constance, Allemagne).

Figure 2 : Reconstitution de particules de PulD examinés par microscopie électronique (cliché de M. Chami et A. Engel, Bâle, Suisse).

Mots-clés: Bactéries, Enterobacteriaceae, sécrétion, membrane externe, maltose, activateur transcriptionnel