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     Génétique et Epigénétique de la Drosophile


  Responsable : Christophe Antoniewski (antoniew@pasteur.fr)


  resume

 

Notre groupe s'intéresse aux mécanismes de contrôle transcriptionnel et post-transcriptionnel au cours du développement des métazoaires. Notre modèle expérimental, la drosophile, nous permet d'aborder ces problématiques en combinant des approches génétiques et moléculaires. Deux projets de recherche sont poursuivis. (i) L'étude de la fonction de l'histone-acétyltransférase (HAT) P/CAF et de son rôle dans le contrôle génétique et épigénétique du développement. (ii) l'analyse des mécanismes de répression post-transcriptionnelle par les ARN double-brin inhibiteurs (RNAi) et les micro-RNA.



  rapport

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1. L'histone-acétyltransférase dP/CAF

Analyse Génétique

Comment les HAT - et le code épigénétique de modification des histones qu'elles génèrent - contribuent-elles à la régulation spécifique des programmes génétiques ?

L'étude de la protéine P300/CBP Associated Factor (P/CAF) chez la drosophile devrait contribuer à établir un tableau intégré du rôle d'une HAT dans la régulation des programmes génétiques, dans le contexte d'un organisme entier en développement.

L'isolement et l'analyse de mutants du gène Pcaf constituent la pierre angulaire de notre projet. Nous avons isolé et caractérisé une insertion d'un élément transposable P, environ 500 pb en amont du gène Pcaf. Cette insertion n'est pas un allèle de Pcaf et perturbe la fonction d'un autre gène. Cependant, en remobilisant l'élément P, nous avons pu générer une courte déficience qui couvre le gène Pcaf. Nous nous servons maintenant de cette déficience pour cribler des mutants générés par exposition à l'ethyl methyl sulfonate. Une fois isolés, les allèles mutants du gène Pcaf nous servirons pour analyser les phénotypes associés aux défauts de fonction de P/CAF et les perturbations entraînées au niveau des programmes génétiques de développement.

Sans attendre d'être en possession d'un allèle du gène Pcaf, nous avons construit un vecteur UAS-IR[Pcaf] permettant l'expression contrôlée d'ARN double-chaine dirigé contre l'ARNm Pcaf. Nous avons déjà montré que ce vecteur permet l'inactivation de Pcaf par interférence à l'ARN. L'utilisation des pilotes GAL4 appropriés, nous permet d'invalider spécifiquement la fonction de Pcaf dans différents tissus au cours du développement. Ceci nous permet d'analyser le rôle spécifique de Pcaf dans le développement d'un lignage cellulaire particulier, ou dans la fonction d'un organe. Il nous est possible d'inactiver spécifiquement le gène Pcaf dans les glandes salivaires des larves de drosophile. Nous allons donc pouvoir analyser, par immunomarquage, comment varient les profils d'acétylation des chromosomes polytènes de ce tissu, en absence de dP/CAF. Ceci pourrait permettre de mettre en évidence un rôle de cette HAT dans la régulation de cibles génétiques spécifiques.

Domaines fonctionnels de la protéine dP/CAF

Nous avons établi une collection de lignées transgéniques exprimant la protéine P/CAF sauvage ou mutée dans ses différents domaines remarquables (site catalytique HAT, bromodomaine, domaine d'interaction avec les récepteurs nucléaires, etc…). Nous allons dans un premier temps analyser par immunomarquage comment ces différents variants se distribuent au niveaux des chromosomes polytènes des glandes salivaires, de façon à déterminer la contribution des différents domaines de P/CAF à son ciblage spécifique sur la chromatine. Une fois en possession d'un allèle mutant du gène Pcaf, nous pourrons par ailleurs effectuer une analyse de la relation structure-fonction dans la protéine P/CAF, en testant la capacité des différents variants à sauver la létalité et/ou les phénotypes observés.

2. Analyse des mécanismes d'interférence génétique par l'ARN double-brin et les micro-ARNs.

L'introduction d'ARN double-brin dans la cellule provoque la dégradation de l'ARN messager de séquence correspondante. Ce processus d'interférence par ARN (RNAi) est à la base de systèmes de régulations endogènes. Chez les plantes, il sert de mécanisme de défense contre les virus lors d'une infection. Un nombre croissant de données indique par ailleurs que l'expression d'ARN double-brin correspondant aux séquences centromériques des chromosomes est responsable de leur heterochromatinisation. Enfin, des mécanismes apparentés au RNAi se révèlent impliqués dans des phénomènes de co-suppression génique, de répression de l'activité d'éléments transposables et d'empreintes chromosomiques parentales.

Les micro-RNA sont de petits ARN en " épingle à cheveux " partiellement double-brin, codés par le génome. Il en est maintenant décrit plus d'une centaine, chez la drosophile comme chez les vertébrés. Leur maturation met en jeu des voies métaboliques communes avec celles de l'interférence par ARN. Cependant, au lieu de provoquer la dégradation de leurs ARNm cibles, les micro-ARN agissent en inhibant leur traduction. Il est récemment apparu que les micro-ARN sont impliqués dans des cascades de régulation génétiques contrôlant le développement, la prolifération cellulaire ou l'apoptose.

Nous avons abordé l'interférence par l'ARN chez la drosophile comme une méthode permettant de contrôler l'inactivation d'un gène dans un animal transgénique (Fig. 2). Le système développé à montré tout son intérêt dans la mesure où il permet de contrôler la dégradation d'un ARNm cible dans un tissus particulier ou à un stade donné du développement (Fig. 3). Nous souhaitons maintenant étudier la contribution des ARN double-brin aux mécanismes de régulations génétiques endogènes mis en œuvre par le génome. Pour cela, nous suivons deux lignes directrices.

Une première ligne consiste à analyser le rôle de micro-RNA dans le contrôle du développement de la drosophile. Ce projet est abordé en étudiant l'effet de perturbations de la machinerie des micro-RNA, par utilisation d'inhibiteurs de virus de plantes, par surexpression ectopique de micro-RNA ou par surexpression de séquences cibles de micro-RNA.

Une deuxième ligne consiste à tester, à l'aide des outils transgéniques que nous avons élaborés, si le ciblage d'ARN double-brin au niveau de séquences régulatrices non-codantes peut induire une inactivation transcriptionnelle (Transcriptional Gene Silencing, TGS) et/ou une hétérochromatinisation des séquences ciblées.

Légendes des photos :

Figure 1 : Protocole de croisement génétiques effectués lors d'une mutagenèse à l'EMS visant à isoler des mutations du gène Pcaf

Figure 2 : Utilisation d'un système transgénique pour cibler l'interférence par l'ARN chez la drosophile.

Une lignée exprimant le facteur GAL4 sous le contrôle d'une promoteur spécifique est croisée avec une lignée exprimant une séquence en répétition inverse sous le contrôle de sites de régulation UAS, cibles de GAL4.

Figure 3. Utilisation du système transgénique pour inactiver le gène Pcaf par RNAi.

L'expression d'un transgène induisant un RNAi contre Pcaf est visualisée grâce à la coexpression du marqueur fluorescent GFP (en vert), au niveau du territoire présomptif distal d'un disque imaginal de patte (en haut) ou de part et d'autre de la frontière dorso-ventrale dans un disque imaginal d'aile (en bas). L'expression de la protéine Pcaf, révélée par un anticorps spécifique (en rouge), est spécifiquement abolie au niveau de ces territoires.

Mots-clés: Drosophile, Génétique, Epigénétique, Histone acetyltransférase, interférence par l’ARN, micro-RNA



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Dulieu Isabelle p8986 email : idulieu@pasteur.fr Antoniewski Christophe – CNRS - responsable du groupe – antoniew@pasteur.fr

Szymczak Dimitri – Etudiant en Thèse – szymczak@pasteur.fr

Carré Clément – Etudiant en Thèse – carre@pasteur.fr

Kirschner Doris – Post-Doctorante – doris@pasteur.fr
  Pidoux Josette – Technicienne supérieure – jpidoux@pasteur.fr

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