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     Embryologie Moléculaire


  Responsable : BRÛLET Philippe (pbrulet@pasteur.fr)


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Le répertoire comportemental de l'animal nécessite l'établissement de connexions neuronales spécifiques au cours de l'embryogenèse. L'analyse de la spécification génétique et du fonctionnement des circuits neuronaux pendant l'embryogenèse est au centre de nos activités de recherche. Des outils génétiques sont développés pour une imagerie moléculaire qui permette de visualiser l'organisation synaptique fonctionnelle des circuits neuronaux pendant leur mise en place et leur maturation dans des animaux transgéniques.



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I - Analyse génétique de l'organisation synaptique fonctionnelle au cours du développement du cerveau murin

Nous avons construit des protéines hybrides entre un fragment non toxique de la toxine tétanique (TTC) et un gène rapporteur, LacZ ou GFP. Les molécules hybrides conservent les propriétés de transport rétrograde et trans-synaptique de la toxine et renseignent sur la signalisation rétrograde dans des circuits neuronaux. Les voies de signalisation antérograde et rétrograde sont essentielles à la maturation et au fonctionnement de la synapse, pendant le développement et la vie adulte. Nous cherchons à caractériser le transport rétrograde et trans-synaptique détecté par nos sondes GFP-TTC à la jonction neuromusculaire et à la synapse centrale, mais aussi dans des situations physiologiques du système nerveux en développement. Des informations sur les voies d'endocytose et de propagation des toxines dans le SNC seront aussi obtenues. En parallèle, une approche d'imagerie calcique de l'activité dans des ensembles neuronaux est poursuivie avec le gène bioluminescent sensible au calcium GFP-aequorine.

a) La jonction neuromusculaire (Cécile Saint Cloment, collaboration UPR9040 du CNRS Sylvie Roux et Jordi Molgo)

La neurotoxine tétanique au cours de l'évolution a parasité des voies cellulaires constitutives pour son internalisation et son transport. L'utilisation de protéines hybrides, contenant le fragment C-terminal atoxique de la neurotoxine tétanique, permet l'analyse in vivo de ces voies d'endocytose impliquées dans le transport intra- et intercellulaire. Par injection intramusculaire, on observe une concentration très rapide des protéines de fusion correspondantes à la jonction neuromusculaire.

Ces protéines, après internalisation neuronale, sont transportées de façon rétrograde jusqu'aux dendrites du motoneurone puis dans les cellules interconnectées. La dynamique de cette concentration et de cette internalisation dépend de l'activité nerveuse pré-synaptique et fait intervenir en partie des microdomaines lipidiques. D'autre part, ce transport in vivo, est fortement influencé par différents facteurs neurotrophiques. On visualiserait donc ainsi une connexion entre l'activité nerveuse via la signalisation rétrograde et le trafic membranaire de ces radeaux lipidiques. Un tel trafic représenterait un mécanisme d'intégration et de transmission de l'information au sein du réseau neuronal actif. La caractérisation des mécanismes, des structures cellulaires ainsi que des facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans l'endocytose de ces marqueurs cellulaires nécessite des observations par microscopie optique mais également électronique ainsi que différentes études biochimiques et électrophysiologiques.

b) Caractérisation du trafic vésiculaire dans des réseaux neuronaux simples (Rafael Vazquez-Martinez)

Le but principal du projet est d'élucider les divers aspects cellulaires de la signalisation rétrograde détectée avec TTC dans le système nerveux central. Nous utilisons donc les caractéristiques du fragment c terminal de la toxine tétanique couplée à la GFP, à savoir son accrochage à la membrane des neurones ainsi que son transport transneuronal. L'endocytose et la transcytose de TTC implique des mouvements de vésicules et de membranes qui sont régulés entre autres par un facteur neurotrophique abondant le BDNF. Nous postulons que ces trafics vésiculaires apportent et emportent aux synapses actives, aussi bien du côté pré-synaptique que du côté post-synaptique, divers composés nécessaires au bon fonctionnement de la synapse active. Expérimentalement, pour vérifier ces hypothèses, nous utilisons la microscopie confocale time-lapse sur des neurones pyramidaux dans des coupes organotypiques , soumises à diverses conditions électrophysiologiques et pharmacologiques. Nous cherchons à visualiser les fluctuations de la fluorescence intracellulaire associée à TTC et à la corréler à des remodelages de la morphologie des épines dendritiques. Nous pensons ainsi obtenir des renseignements importants sur les mécanismes cellulaires impliqués dans les trafics membranaires à la synapse active.

c) Analyse de l'organisation synaptique fonctionnelle chez l'embryon et l'animal transgénique (Sandrine Picaud, Thomas Curie)

Des animaux transgéniques ont été construits dans lesquels le gène rapporteur GFP-TTC est placé sous le contrôle de promoteurs spécifiques du système nerveux central. L'imagerie du réseau neuronal est obtenue par la détection de la protéine après son transport à travers des synapses actives au sein du réseau. D'autres lignées de souris utilisant la mutagenèse dirigée et le déclenchement conditionnel pour l'expression du gène rapporteur sont en construction pour l'étude des mécanismes génétiques sous-jacents à la mise en place des réseaux au cours du développement. L'imagerie par microscopie confocale à multiphotons permet de suivre le transport intracellulaire et trans-synaptique. Cette approche d'imagerie moléculaire permettra de mieux analyser la plasticité synaptique pendant la mise en place des réseaux neuronaux.

d) Visualisation de l'activité neuronale par imagerie bioluminescente (Kelly Rogers, Cendra Agulhon,Jacques Stinnakre)

Nous avons développé une approche expérimentale pour visualiser en temps-réel l'activité d'un réseau neuronal dans un tissu nerveux ou dans l'animal entier en utilisant la protéine bioluminescente sensible au calcium GFP-aequorine. La fluorescence de la GFP permet de visualiser le patron d'expression du gène rapporteur dans la cellule. De plus, lorsque le calcium s'accroche à l'aequorine, un transfert d'énergie chemiluminescence a lieu, appelé CRET. Il s'ensuit que la GFP émet une lumière bioluminescente verte bien plus intense que celle produite par l'aequorine seule. Cette luminescence, induite par le calcium, ne demande pas une stimulation par une radiation et son excellent signal au bruit lui permet d'être utilisée pour une imagerie de très longue durée sans effets nocifs sur les tissus. Nous avons montré que cette protéine pouvait être génétiquement ciblée à différents compartiments cellulaires et protéines, notamment dans les parties pré et post-synaptiques sans perte de fonction. D'autre part, la protéine rapporteur peut-être ciblée par transgènese à une sous-population de cellules chez l'animal. Une signalisation calcique très localisée au niveau de la cellule peut être visualisée pour des temps prolongés. Nous disposons d'un système d'imagerie très sensible qui permet de combiner la détection de la fluorescence et de la bioluminescence. Un appareillage pour la stimulation et l'enregistrement de signaux électrophysiologiques complète l'ensemble nous permettant de visualiser les changements dynamiques d'activité dans des circuits neuronaux actifs, avec une résolution temporelle inégalée dans des tissus normaux et pathologiques. Ces études permettront aussi d'évaluer les rôles du calcium dans la formation et le fonctionnement d'ensembles neuronaux.

II - Isolement de cellules souches à partir de cellules somatiques (H. Le Mouellic)

Au cours de ces dernières années, des animaux vivants ont été obtenus après transplantation de noyaux de cellules somatiques dans l'œuf. Cette technique a été couronnée de succès chez de nombreux mammifères. Par ailleurs, la fusion d'une cellule souche embryonnaire (ES) avec une cellule somatique produit un hybride cellulaire possédant des propriétés de pluripotence. Des facteurs encore non identifiés, mais localisés dans le cytoplasme de l'œuf ou exprimés dans les cellules ES, permettent de réinitialiser le programme génétique du développement et reprogramment les gènes de façon coordonnée. Ce phénomène intervient aussi naturellement, par exemple chez l'amphibien Urodèle lorsqu'une patte est sectionnée. Des cellules somatiques dédifférencient, prolifèrent et reforment de nouveaux tissus. Sachant que la reprogrammation génétique peut se faire, nous étudions la possibilité d'isoler directement des cellules souches à partir de cellules somatiques, par mutagenèse exhaustive.

Nous avons construit une lignée de souris transgéniques comprenant un marqueur génétique des cellules pluripotentes. Un promoteur minimal a été associé aux séquences activatrices qui sont responsables de l'expression de Oct-4 dans les cellules souches embryonnaires (ES). Le marqueur est une protéine de fusion qui expose la protéine fluorescente verte (GFP) sur la surface externe des cellules (photo). Le transgène est correctement exprimé dans les cellules ES. L'examination des animaux transgéniques dira si d'autres types de cellules souches adultes peuvent être identifiés avec ce gène rapporteur. Une mutagénèse insertionnelle par vecteurs viraux pourrait être effectuée sur différentes populations cellulaires obtenue à partir de ces souris. La présence de plusieurs épitopes permet d'isoler les rares évènements positifs en utilisant la puissante technique du tri magnétique.

Légendes des photos :

photo 1 : Localisation du marqueur GFP-TTC à la jonction neuromusculaire. Après injection in vivo à proximité du muscle Levator auris longus, GFP-TTC (vert) est localisé très rapidement au niveau de la jonction neuromusculaire. Les axones moteurs associés sont visualisés à l'aide d'un anticorps antineurofilament 200(rouge).

photo 2 : Image par microscopie confocale multiphotonique d'un neurone pyramidal cortical dans une coupe organotypique de 400 m, exprimant GFP-TTC (Echelle : 15m)

photo 3 : (A) Bioluminescence induite par du calcium dans des neurones corticaux exprimant la GFP-aequorine

(B) fluorescence de la GFP

(C) image par transmission. Pseudo-couleurs correspondant á 1 - 9 photons/pixel

photo 4 :GFP ciblée à la surface de cellules HEK 293

Mots-clés: Neurobiologie du développement, dé-différenciation, organisation synaptique, imagerie calcique, transgenèse, cellule-souche



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SAINT CLOMENT Cécile (IP - Technicienne) : ccloment@ pasteur.fr

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