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     Cytokines et Inflammation


  Responsable : Cavaillon Jean-Marc (jmcavail@pasteur.fr)


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Nous étudions la production des cytokines et leur l'implication dans diverses pathologies inflammatoires systémiques (sepsis, traumatologie, ischémie-reperfusion, mucoviscidose). Nous analysons, au niveau de la signalisation intracellulaire, la dérégulation immunitaire observée au sein des cellules circulantes, réminiscence du phénomène de tolérance aux endotoxines, et qui pourrait être associée à la susceptibilité accrue de ces patients aux infections nosocomiales. Enfin, nous étudions les mécanismes d'induction des cytokines par les produits bactériens (ou "PAMPs" pour pathogen-associated molecular patterns).

Les thèmes abordés concernent autant la recherche fondamentale que la recherche biomédicale, cette dernière étant menée en collaboration avec plusieurs services hospitaliers de la région parisienne.



  rapport

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1- BASES MOLÉCULAIRES DE L'IMMUNODÉPRESSSION LORS D'UNE RÉACTION INFLAMMATOIRESYSTÉMIQUE (M. Adib-Conquy)

Depuis la découverte au laboratoire (Muñoz et al. J. Clin. Invest. 1991, 88, 1747) de l'altération de la production de cytokines ex vivo par les monocytes de sujets sepsis, nous nous sommes intéressés au processus d'immunodépression associé au syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS). Nous avons décrit ce même phénomène chez des patients après chirurgie (Cabié et al. Cytokine 1992, 4, 576) ou chez des patients réanimés après un arrêt cardiaque (Adrie et al. Circulation 2002, 106, 562). Nous avons étendu et précisé ce phénomène au niveau des neutrophiles (Marie et al. Blood 1998, 91, 3439) et des lymphocytes T (Muret et al. Shock 2000, 13, 169). Nous avons analysé les mécanismes moléculaires intracellulaires qui président à l'immunodépression observée chez les patients SIRS. Une diminution de la translocation du facteur nucléaire -κB (NFκB), un déséquilibre entre les formes active (p65p50) et inactive (p50p50), et une très faible expression cytoplasmique de son inhibiteur (IκBα), ont été observés chez les patients sepsis, semblables à ce qui a été décrit lors du phénomène de tolérance aux endotoxines (Adib-Conquy et al. Am. J. Respir. Crit Care Med. 2000, 162, 1877). La perturbation de l'expression de NF-κB perdure plus de 10 jours chez des patients de traumatologie (Adib-Conquy et al. J. Leuk. Biol. 2001, 70, 30).

L'immunodépression est attestée au niveau des cellules mononucléées par une forte altération de la production de tumor necrosis factor (TNF) en réponse au lipopolysaccharide (LPS) d'Escherichia coli et au motif CpG des ADN bactériens, ainsi que par une altération de la production d'interleukine-6 (IL-6) en réponse à l'IL-1 et au TNF. Néanmoins, il ne s'agit pas d'une altération globale puisque les cellules demeurent réactives à d'autres stimuli (germes tués de Staphylococcus aureus ou de Streptococcus pyogenes, et le LPS de Leptospira interrogans, un ligand du Toll-like receptor 2 (TLR2)) et continuent à produire de l'interleukine-10 et de l'IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) en réponse au LPS d'E. coli. Nous avons montré que l'expression normale de TLR-2 et celle réduite de TLR4 ne pouvaient pas à elles seules expliquer l'altération de la signalisation observée dans les cellules de sujets SIRS. En effet, contrairement à la voie TLR2, la voie TLR4 aboutissant à la production de TNF est altérée. Par contre, la signalisation via TLR4 aboutissant à la production d'IL-10 (activation de la p38 MAPK et du facteur de transcription Sp-1) est amplifiée dans les cellules de sujets SIRS (figure 1). Ce travail démontre que l'hyporéactivité leucocytaire n'est pas un phénomène universel, mais qu'elle dépend des voies d'activation utilisées, certaines pouvant être altérées, tandis que d'autres demeurent fonctionnelles, voire surexprimées (Adib-Conquy et al. Am. J. Respir. Crit Care Med. 2003, 168, 158).

2- PRODUCTION DE MIF AU COURS DU SEPSIS (V. Maxime, C. Fitting)

Le macrophage migration inhibitory factor (MIF) est une cytokine inflammatoire qui s'oppose aux effets des glucocorticoïdes. En collaboration avec le Prof. D. Annane (Hôp. R. Poincaré, Garches), nous avons analysé chez les patients sepsis la production de MIF in vitro par les leucocytes sanguins de sujets normaux et de patients sepsis, en réponse à différents activateurs. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) des patients sepsis contiennent des taux intracellulaires de MIF plus élevés que les cellules de sujets sains. Mises en culture, les PBMC de patients sepsis libèrent spontanément plus de MIF que les cellules de sujets sains ainsi qu'en réponse à certains stimuli. Par contre, les PBMC des patients sepsis traités par les glucocorticoïdes présentent une normalisation de leur libération de MIF. Ainsi, le MIF apparaît comme la première cytokine pro-inflammatoire décrite dont la libération ex vivo par les cellules circulantes est accrue au cours du sepsis. À l'inverse des modèles animaux, le traitement des patients en choc septique par les glucocorticoïdes normalise la libération de MIF par leurs leucocytes.

3- CYTOKINES ET MUCOVISCIDOSE (A-F. Petit-Bertron, M. Adib-Conquy, C. Fitting)

Nous étudions les neutrophiles (PMN) isolés de liquide d'expectoration d'enfants souffrant de mucoviscidose (CF). Ceux-ci présentent une production spontanée ex vivo très élevée d'IL-8 comparativement aux PMN sanguins. Celle-ci ne peut pas être accrue par le LPS ni inhibée par la dexamethasone, contrairement à ce qui est observé avec les neutrophiles circulants (Corvol et al. Am. J. Physiol. 2003, 284, L997). De même, l'IL-10 qui inhibe la production d'IL-8 par les PMN sanguins de sujets sains et CF stimulés par des produits bactériens (LPS, peptidoglycane), est sans effet sur la production d'IL-8 par les PMN dérivés des liquides d'expectoration. Chez ces patients, des altérations d'expression de marqueurs de surface se retrouvent aussi bien sur les neutrophiles sanguins que sur ceux dérivés des liquides d'expectoration. L'expression de TLR2 est significativement réduite à la surface des PMN sanguins de sujets CF, tandis que l'expression de TLR4 est significativement accrue à la surface des PMN d'expectoration. L'expression de CD64, (récepteur Fcγ type I), marqueur d'activation, est fortement accrue à la surface des PMN circulants des enfants CF. Les neutrophiles issus des voies aériennes de patients CF, en interaction avec des cellules épithéliales respiratoires CF présentent une durée de vie significativement augmentée comparativement aux neutrophiles sanguins des mêmes patients et aux neutrophiles collectés chez des sujets sains (réduction de l'apoptose). Par ailleurs, l'interaction entre neutrophiles de patients CF et cellules épithéliales bronchiques CF induit une amplification (x 7) de la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et IL-8), comparativement à des co-cultures de neutrophiles de sujets sains avec des cellules épithéliales bronchiques normales. (Ces travaux sont menés en collaboration avec les Drs H. Corvol, O. Tabary, J. Jacquot et A. Clément (Hôp. Trousseau) et sont financés par l'Association "Vaincre la Mucoviscidose").

4- SIGNALISATION VIA LES VOIES TOLL-LIKE RECEPTORS et NOD1 (M. Adib-Conquy, R.Kapetanovic, C. Fitting )

Dans le cadre du programme transversal de recherche (PTR 94) coordonné par Catherine Werts et en collaboration avec Dana Philpott et Stephen Girardin, nous cherchons à caractériser l'implication des molécules TLR2, TLR4, TLR9 et Nod1 dans l'induction des voies de signalisation qui mènent à des productions différentielles de TNF ou d'IL-10. Pour se faire, de nombreux PAMPs ont été testés sur des macrophages péritonéaux de souris déficientes pour TLR2 et TLR4. Nos résultats montrent que l'absence de TLR2 et TLR4 entraîne une perte importante de la réponse aux bactéries à Gram négatif (BG-), alors que la réponse aux bactéries à Gram positif (BG+) n'est pas du tout affectée. Les récepteurs TLR2 et TLR4 ne sont donc pas indispensables pour la réponse des macrophages aux BG+. Par contre, la phagocytose de ces germes est une étape importante pour induire la production de cytokines par ces dernières et son inhibition par la cytochalasine D entraîne une forte inhibition de cette production. D'autre part, à l'aide d'expériences de transfection dans une lignée macrophagique de souris, en surexprimant des dominants négatifs de MyD88, Nod1 et Nod2, nous avons montré que toutes ces molécules semblent contribuer à l'activation du facteur de transcription NF-κB en réponse à S. aureus. Nod1 ne reconnaît pas directement le peptidoglycane des BG+, mais pourrait jouer un rôle régulateur dans la réponse à Nod2. Ce qui expliquerait aussi la plus faible production d'IL-10 par les macrophages des souris Nod1-/- en réponse à S. aureus.

5- ETUDE DU PHÉNOMÈNE DE TOLÉRANCE AUX ENDOTOXINES (C. Fitting, M. Adib-Conquy)

Après une injection de LPS chez la souris, nous avons analysé ex vivo l'état de tolérance aux endotoxines de cellules issues de différents compartiments (rate, moelle osseuse, péritoine, poumon, sang périphérique) ainsi que le niveau de tolérance croisée avec des germes tués de S. aureus. L'analyse est effectuée en termes de production de TNF. Le phénomène de tolérance s'établit avec des cinétiques différentes et pour des durées différentes au niveau des splénocytes, des cellules des lavages péritonéaux, des cellules de la moelle osseuse et des cellules circulantes. Par contre, les cellules des lavages alvéolaires n'acquièrent qu'un état de tolérance très modeste et de courte durée. La tolérance croisée avec les germes de Staphylocoque n'est pas parallèle à l'état de tolérance aux endotoxines. Ces travaux démontrent la compartimentalisation de la tolérance et le comportement particulier des cellules alvéolaires (Fitting et al. J.Infect. Dis. 2004, in press)

D'autre part, nous avons étudié la capacité de l'interféron gamma (IFNγ) ou du granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF) à lever l'état de tolérance. Dans les cellules tolérantes au LPS, IRAK-1 est peu exprimé. L'IFNγ et le GM-CSF permettent de rétablir l'expression d'IRAK-1 dans les monocytes tolérisés par une faible dose de LPS, mais pas avec une forte dose. L'activation d'IRAK-1 et son association à MyD88 sont également favorisées par l'IFNγ et le GM-CSF. Ces cytokines permettent donc, dans le cas d'une tolérance induite par une faible concentration de LPS, de rétablir dans les monocytes l'activation d'IRAK-1, son association avec MyD88, l'activation de NFκB en réponse au LPS, et en final la production de TNF (Adib-Conquy & Cavaillon, J. Biol. Chem. 2002, 277: 27927).

6- MODULATION PAR L'ADHÉRENCE DES PROPRIÉTÉS DE L'INTERLEUKINE-10 (A-F. Petit-Bertron, M. Adib-Conquy)

L'adhérence des monocytes influence les propriétés immunomodulatrices de l'IL-10. Nous avons montré qu'en réponse à une stimulation ultérieure par le LPS, des monocytes prétraités avec de l'IL-10 dans des conditions qui préviennent l'adhérence des cellules, produisent davantage de TNF, alors que dans des conditions d'adhérence, l'IL-10 inhibe cette production. Cet effet paradoxal est retrouvé au niveau de l'ARNm du TNF et du facteur de transcription NF-kB (Adib-Conquy et al. Int. Immunol. 1999, 11, 689). Les cinétiques d'activation de STAT-3, tyk2 et d'induction de suppressor of cytokine signaling (SOCS)3 et de l'hème oxygenase-1, en réponse à l'IL-10 sont influencées par l'existence de l'adhérence leucocytaire (Petit-Bertron et al. J. Leuk. Biol. 2003, 73, 145). L'influence de l'adhérence et de l'IL-10 a été étudiée par macroarray sur l'expression de 1050 gènes. En absence d'adhérence, l'IL-10 induit l'expression de 45 gènes et en réprime 67, tandis qu'en présence d'adhérence, l'IL-10 induit l'expression de 21 gènes et en réprime 50. Seuls 3 gènes communs sont induits et 35 réprimés. Nous avons confirmé par RT-PCR et après analyse des protéines certaines modulations. Dans les cellules adhérentes, l'IL-10 inhibe fortement l'expression de la coproporphyrinogene oxidase (enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'hème), ce qui pourrait être un des mécanismes par lesquels l'IL-10 contribue à l'anémie. En absence d'adhérence, l'IL-10 inhibe l'expression des gènes codant pour SOCS1, 2 et 3, ce qui pourrait contribuer à ses effets pro-inflammatoires observés dans ces conditions de culture. En effet, SOCS1 et SOCS3 inhibent la signalisation induite par le LPS via le TLR4. De plus, en absence d'adhérence, l'IL-10 induit l'expression de plusieurs metalloprotéinases, molécules trouvées dans la circulation sanguine lors d'états inflammatoires. Ces observations confirment les effets ambivalents de l'IL-10, et notre modèle pourrait mimer des évènements consécutifs à l'activation dans la circulation sanguine, de monocytes appelés à adhérer à l'endothélium et à migrer au sein des tissus inflammatoires (figure 2). Ce travail a été effectué en collaboration avec T. Pedron et la plate forme 2, puces à ADN de l'IP.

7- SÉROTONINE ET PRODUCTION DE CYTOKINES (I. Cloëz-Tayarani)

La sérotonine (5-hydroxytryptamine = 5-HT) est libérée par les plaquettes activées et peut se trouver à des concentrations micromolaires aux sites d'inflammation. Nous avons étudié l'effet de la 5-HT sur la production de cytokines par les PBMC humaines activées par le LPS, et sur la régulation de l'expression de leurs gènes. La 5-HT régule de façon différentielle la production de cytokines : elle inhibe significativement et de façon dose-dépendante la production de TNF tandis qu'elle augmente à plus fortes doses celle d'IL-1β. L'effet inhibiteur de la 5HT est réversé par un antagoniste sélectif du récepteur 5HT2A (kétansérine) et mimé par un agoniste sélectif des récepteurs 5HT2A/2C (DOI). Ces résultats qui suggèrent l'implication du récepteur 5HT2A dans les effets de la sérotonine, sont confirmés par l'identification par Western-blot de ce récepteur au niveau des PBMC. Ces résultats suggèrent l'implication de la sérotonine dans la modulation des processus inflammatoires et la production de cytokines (Cloëz-Tayarani et al. Int. Immunol. 2003, 15, 233). Une étude plus récente démontre l'activation de l'extracellular signal-regulated kinase (ERK) au sein des lymphocytes mis en présence de sérotonine. Le phénomène semble être lié à l'activation via un récepteur 5-HT1A puisque des résultats similaires sont obtenus en présence de R-(+)-8-hydroxy-DPAT, un agoniste sélectif du récepteur 5-HT1A . De plus, la phosphorylation de ERK induite par la sérotonine est inhibée en présence de WAY100635, un antagoniste sélectif du récepteur 5-HT.

Légendes

Figure 1. Illustration schématique des voies de signalisation altérées (sur fond gris) ou amplifiées (trait épais) dans les leucocytes de patients trauma aboutissant à la production de TNF, d'IL-1β, d'IL-1ra et d'IL-10 en réponse à l'activation par des ligands de TLR2 ou de TLR4. Ce schéma tient compte de nos travaux (Adib-Conquy M et al J. Leuk. Biol. 2001; 70:30; Adib-Conquy et al. Am. J. Respir. Crit Care Med. 2003, 168, 158) ainsi que des travaux rapportés dans la littérature (Learn et al. J. Biol. Chem. 2001; 276:20234 ; Solomon et al. J. Clin. Invest. 1998; 102:2019).

Figure 2. La chronologie des signaux, les concentrations locales, la nature des cellules cibles, la présence de co-signaux, la nature des cellules environnantes sont autant d'évènements qui modifient les propriétés de l'IL-10 (Cavaillon J-M. Pro- versus anti-inflammatory cytokines : myth or reality, Cell. Mol. Biol. 2001, 47, 695)

Mots-clés: Toll-like receptor, sepsis, signalisation intracellulaire, endotoxine, immunité innée



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
    Minou Adib-Conquy Chargée de recherche IP madib@pasteur.fr

Isabelle Cloez-Tayarani Chargée de recherche IP (2003)
Anne-France Petit-Bertron Etudiante (thèse) (2003)

Virginie Maxime Etudiante (DEA) (2003)

Ronan Kapetanovic Etudiant en DEA rkape@pasteur.f
Catherine Fitting Technicienne IP cfitting@pasteur.fr

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