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     Biochimie Structurale


  Responsable : ALZARI, Pedro (alzari@pasteur.fr)


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Les travaux de recherche de l'Unité de Biochimie Structurale sont orientés vers l'étude de la structure tridimensionnelle de protéines et la spécificité des interactions protéine-ligands par les moyens de la cristallographie des rayons-X, la biochimie des protéines, la microcalorimétrie et la modélisation moléculaire. Les thèmes centraux de recherche comprennent l'enzymologie structurale de microorganismes pathogènes (mycobactéries, trypanosomes), les glycosidases et la reconnaissance moléculaire de sucres dans différents systèmes biologiques. Au cours de cette dernière année, plusieurs structures cristallines de protéines et de complexes protéine-ligand ont été déterminées dans le laboratoire. Les principaux résultats incluent les études structurales des trans-sialidases de trypanosomes, des glycogène synthases bactériennes, de la proline racemase de Trypanosoma cruzi et de plusieurs protéines de Mycobacterium tuberculosis representant des cibles thérapeutiques potentielles. Les principaux sujets de recherche sont décrits ci-dessous; plus d'information sur les différents projets de recherche en cours dans le laboratoire est disponible dans notre page Web : http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Bstruct/ .



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Trans-sialidases de trypanosomes (P.M. Alzari)

Les protozoaires flagellés Trypanosoma cruzi, l'agent causal de la maladie de Chagas dans le continent américain, et T. brucei , l'agent de la maladie du sommeil en Afrique, expriment une trans-sialidase de surface capable de catalyser le transfert d'acide sialique entre différentes glycoprotéines. L'expression de cette enzyme chez T. cruzi est directement liée au pouvoir d'infection du parasite. En collaboration avec les équipes de A.C. Frasch (Argentine) et de S. Withers (Canada), nous avons entrepris l'analyse structurale d'enzymes homologues de trypanosomatides pathogènes (T. cruzi, T. brucei) et non-pathogènes (T. rangeli ) afin de comprendre les bases moléculaires de l'activité de transglycosylation (synthèse de polysaccharides) et de permettre la conception rationnelle d'inhibiteurs pouvant servir à des fins thérapeutiques.

Nous avons préalablement déterminé les structures 3D de la sialidase de T. rangeli (Buschiazzo et al, EMBO J., 2000) et de la trans-sialidase de T. cruzi (Buschiazzo et al, Mol. Cell, 2002), et réalisé des études de mutagenèse dirigée des enzymes de T. cruzi (Paris et al, Glycobiol., 2001) et de T. brucei (Montagna et al, Eur. J. Biochem., 2002). Ces études ont montré que les trans-sialidases, à différence des sialidases, présentent un site actif intrinsèquement flexible. La fixation du substrat sialylé déclenche des changements structuraux qui servent à moduler l'affinité pour le substrat accepteur (les mucines chez T. cruzi), créant ainsi les conditions pour une activité de transglycosylation efficace. La comparaison structurale de la trans-sialidase de T. cruzi avec la sialidase de T. rangeli révèle un site catalytique très conservé, au sein duquel des subtiles modifications chimiques et structurales suscitent des changements remarquables dans l'activité catalytique et les propriétés d'inhibition des deux enzymes. Par ailleurs, la comparaison des structures 3D de différents complexes sialidase-inhibiteur - incluant des enzymes d'origine virale, bactérienne et de trypanosomes - révèle des caractéristiques distinctes, qui pourraient être exploitées pour la conception de nouveaux inhibiteurs spécifiques (Amaya et al, J. Mol. Biol., 2003).

Malgré des nombreuses études des sialidases d'origine virale et bactérienne pendant ces vingt dernières années, plusieurs questions concernant leur mécanisme catalytique et la nature chimique des intermédiaires réactionnels restent sans réponse, en grand partie à cause du fait qu'on ne dispose pas d'information structurale sur les différentes espèces enzymatiques formées au cours du cycle catalytique. La trans-sialidase de T. cruzi fourni un système prometteur pour étudier ces intermédiaires, à cause de l'affinité élevée du site de fixation de l'aglycone. Ainsi, en utilisant un substrat activé (acide sialique marquée au fluor), nous avons pu pieger l'état intermédiaire et démontrer que la trans-sialidase (et probablement toutes les sialidases microbiennes) agissent par un mécanisme ping-pong, impliquant la formation d'un complexe covalent sialyl-enzyme avec un résidu tyrosine strictement conservé (Watts et al, J. Am. Chem. Soc, 2003). Par ailleurs, nous avons déterminé les structures tridimensionnelles de cette intermédiaire covalent et de deux complexes enzyme-substrat (complexes de Michaelis) à 1.6 Å de résolution (Amaya et al, 2003, soumis). Ces ‘snapshots' des différentes étapes du cycle réactionnel demontrent que le mécanisme catalytique des sialidases et trans-sialidases est semblable à celui d'autres glycosidases qui agissent avec retention de la configuration, mais présentent quelques différences singulières ayant pu évoluer en réponse à la structure chimique particulier des acides sialiques.

Protéines kinases et phosphatases mycobactériennes (P.M. Alzari)

La phosphorylation réversible des protéines est la principale modification post-translationelle impliqué dans la signalisation cellulaire des organismes vivants. Chez les bactéries, la plupart des voies de signalisation font intervenir les systèmes à deux composantes impliquant une His-kinase et un receveur, tandis que chez les eucaryotes l'information est acheminée grâce à des Sér-, Thr- ou Tyr-kinases et phosphatases agissant en cascades ou en réseaux. Ces dernières années, cependant, plusieurs gènes codant pour des Sér/Thr/Tyr protéines kinases ou phosphatases ont été identifiés chez différentes procaryotes et le séquençage systématique de génomes bactériens a confirmé ces observations. Ainsi, le génome de Mycobacterium tuberculosis montre la présence de plusieurs Sér/Thr protéines kinases et phosphoprotéines phosphatases probablement impliquées dans la signalisation intracellulaire. En collaboration avec l'équipe de S.T. Cole (IP), nous avons entrepris l'étude de cette famille de protéines mycobactériennes afin de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents et de contribuer au développement des nouveaux outils thérapeutiques.

Nous avons focalisé nos travaux sur deux enzymes de M. tuberculosis en particulier, la Ser/Thr protéine kinase PknB et la Ser/Thr phosphatase PstP. Les gènes correspondantes, pknB et pstP, se trouvent dans un opéron très conservé chez les actinobactéries, qui serait impliqué dans la régulation de la synthèse du peptidoglycane au cours de la croissance cellulaire. Les domaines catalytiques de PknB et PstP ont été exprimés chez E. coli et les protéines recombinantes purifiées à homogénéité pour des études biochimiques. La structure 3D de PknB a été déterminée par diffraction des rayons X, démontrant que le repliement de la protéine et l'architecture du site actif sont très semblables à ceux des kinases eucaryotes (Ortiz et al, J. Biol. Chem., 2003). Par ailleurs, nous avons montré que PknB (autophosphorylée) est un substrat de PstP, et que la déphosphorylation affecte son activité enzymatique. Deux thréonines dans la boucle d'activation de PknB (Thr171 et Thr173) ont été identifiés comme les sites de phosphorylation, la substitution de ces résidus par mutagenèse réduisant de manière significative l'activité catalytique. Ces résultats ont mis en évidence un mécanisme de régulation de l'activité kinase chez M. tuberculosis semblable à celui observé chez les homologues eucaryotes, et suggèrent que PknB et PstP pourraient jouer un rôle dans le contrôle de la croissance cellulaire (Boitel et al, Mol. Microbiol., 2003). Des travaux pour identifier les substrats physiologiques de ces enzymes et pour caractériser les propriétés de phosphorylation d'autres kinases mycobactériennes sont actuellement en cours.

La génomique structurale des mycobactéries (P.M. Alzari)

L'arrivée des données issues du séquençage massif des génomes a imposé une nouvelle dynamique à la biologie structurale, entraînant un changement d'échelle dans le domaine et une nécessité d'accélérer les processus d'études au niveau mondial. Cela est maintenant possible grâce aux développements technologiques remarquables réalisés pour le clonage, l'expression, la purification et la caractérisation des macromolécules biologiques, ainsi que par les progrès réalisés dans les méthodes de détermination de structures, la cristallogenèse, la cryocristallographie et le développement de nouvelles sources de radiation synchrotron, pour ne citer que ces exemples. Nous souhaitons utiliser ces technologies pour contribuer au développement d'une meilleure chimiothérapie de la tuberculose. En particulier, nous nous proposons d'utiliser la génomique structurale comme un outil innovateur pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Grâce au soutien du Réseau National des Génopoles, des projets européens X-TB et SPINE, et de l'Institut Pasteur, nous avons entrepris un projet de génomique structurale de mycobactéries. Le choix initial de cibles s'appuie sur l'analyse comparative des génomes de M. tuberculosis et M. leprae. Ces cibles incluent, d'une part, des protéines impliquées dans la croissance bactérienne et/ou la virulence des mycobactéries, mais aussi un nombre important de protéines de fonction inconnue dont l'analyse génomique suggère leur possible importance comme cibles thérapeutiques potentielles. Les subventions accordées pour la réalisation du projet nous ont permis de mettre en place deux plates-formes technologiques, l'une pour la production de protéines recombinantes (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF5) et l'autre pour le clonage et la cristallogenèse à haut débit (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF6). A présent, plus de 300 gènes mycobactériens ont été clonés dans des vecteurs d'expression bactériens, plusieurs protéines purifiées ont été soumises à des essais de cristallisation et les premières structures tridimensionnelles ont été déterminées au cours de la dernière année. L'état actuel du projet est décrit dans la page Web " Structural Genomics of Mycobacteria " (http://www.pasteur.fr/SGM)

Etudes structurales de Polymérases bactériennes, virales et eukaryotes (M. Delarue)

La TdT appartient a la famille des polymérases bêta, lambda et mu (ou pol X). Cette classification établie sur la base de comparaisons de séquences est confirmée par de nombreuses études fonctionnelles. Il a été récemment montre que la pol lambda possède une activité nucleotidyl transferase. Pol beta et pol lambda sont impliquées dans la réparation de l'ADN par le mécanisme de l'excision de la base non correcte suivie d'une nouvelle synthèse. La pol mu est impliquée dans la réparation de coupures double-brin de l'ADN par religation des bouts (Non-Homologous End Joining process, NHEJ). La réaction implique un complexe de plusieurs protéines comme la ligase IV, XRCC4 et Ku70/80, qui sont également nécessaires au bon fonctionnement de la Tdt. Il semble que ce genre de complexe soit aussi présent dans la levure et même chez les bactéries, même si la TdT n'a pas d'équivalent a proprement parler chez les procaryotes.

La Tdt est capable d'allonger un "primer" (amorce) oligonucléotidique long d'au moins 3 bases, a partir des dNTP présents en solution, ajoutées aléatoirement puisque l'enzyme fonctionne sans matrice à recopier. On pense qu'elle est responsable in vivo de la génération d'une partie de la diversité de la réponse du système immunitaire en rajoutant des régions N de longueur variable à la jonction V(D)J des gènes des immunoglubulines. Le but de cette étude, en collaboration avec l'Unité de Biochimie et de Génétique du Développement dirigée par F. Rougeon, est de caractériser structuralement la spécificité relativement étendue de cette enzyme vis-à-vis de nucléotides triphosphates modifiés et le rôle des ions métalliques dans la modulation de cette spécificité. A terme, une étude structurale du complexe entier avec la ligase IV, XRCC4 et Ku70/80 pourrait être envisagée. La structure du domaine catalytique a été résolue a 2.35 Å de résolution. Des complexes avec un oligonucléotide primer oligo(Br-dU) et un dNTP rentrant ont également été affinés à moyenne résolution. Ceci a été publié dans EMBO J. en 2002. Puis des données à plus haute résolution pour un complexe binaire avec un oligo(A) à 2.1 Å ont été affinées, ainsi que plusieurs autres complexes avec des dNTP rentrants (purine ou pyrimidine) en présence de divers ions divalents. Nous avons ainsi mis en évidence un site supplémentaire d'un ion divalent près du site actif, qui semble moduler la spécificité d'incorporation d'une purine plutôt que d'une pyrimidine. Le rôle d'ions monovalents comme le K+ a été élucidé grace à son remplacement par le Rb+, qui possède un signal anomal qui a été effectivement observé. Celui des ions Cl- a également été mis en évidence grâce à son remplacement par du Br-, ce qui a permis une assignation non ambiguë de la densité électronique. Enfin, des complexes avec des analogues de nucléotides ont été obtenus et enregistrés.

Nous sommes en train d'étendre notre étude à la polymérase mu, qui est la plus proche "cousine" de la TdT dans les banques de séquences. Celle-ci a la particularité de supporter un brin template, bien qu'elle possède la boucle responsable de l'exclusion de ce brin dans la TdT. Nous espérons comprendre ce phénomène en résolvant la structure de la pol mu par RX. Parallèlement, des études de simulation de cette boucle ont été lancées grâce à une collaboration avec YH Sannejouand (ENS, Lyon). Parallèlement a ces études expérimentales, des études théoriques visant à comprendre la réaction de polymérisation ont été entreprises, en particulier grâce aux modes normaux calcules sur un modèle physique très simplifie des protéines (M. Delarue, YH Sanejouand). Nous nous servons également des modes normaux pour mettre au point des méthodes nouvelles d'affinement de modèles dans des données de diffraction (M. Delarue, Ph. Dumas). Enfin, des études sur la solvatation des protéines ont été entreprises (C. Azuara); elles devraient déboucher sur de meilleures techniques de découvertes d'inhibiteurs par "drug-design".

Mots-clés: biologie structurale, diffraction des rayons X, protéines kinases bactériennes, glycosidases et glycosyl transferases, tuberculose, Trypanosoma cruzi, polymérases, génomique structurale



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
    Alzari, Pedro M., IP (Chef de Laboratoire, alzari@pasteur.fr)

Buschiazzo, Alejandro, IP (CR, alebus@pasteur.fr)

Delarue, Marc, CNRS (DR2, delarue@pasteur.fr)

Pecorari, Frederic, CNRS (CR, pecorari@pasteur.fr)

Schaeffer, Francis, IP (CR, fschaeff@pasteur.fr)
Amaya, Maria Fernanda, Post-doc (amaya@pasteur.fr)

Azuara, Cyril, Thèse (azuara@pasteur.fr)

Essex, Susannah, Thèse (suzessex@pasteur.fr)

Guerin, Marcelo, Post-doc (mguerin@pasteur.fr)

Fernandez, Pablo, Post-doc (fpablo@pasteur.fr)

Hagnerelle, Xavier, Thèse (hagnerel@pasteur.fr)

Villarino, Andrea, Post-doc (avilarin@pasteur.fr)

Wehenkel, Annemarie, Thèse (wehenkel@pasteur.fr)
Bellune, Alban, IP (Agent de Laboratoire)

Expert-Besançon, Nicole, IP (Ingénieur, nexpert@pasteur.fr )

Formentin, Chantal, IP (Agent de Laboratoire)

Nguyen, Tong, IP (Ingénieur, tong@pasteur.fr )

Souchon, Hélène, CNRS (Ingénieur, hsouchon@pasteur.fr )

Tello-Manigne, Diana, IP (Ingénieur, dtello@pasteur.fr )

Toscan, Isabelle, IP (Agent de Laboratoire)

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