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     Biologie et Pathogénicité fongiques - INRA


  Responsable : d’Enfert, Christophe (denfert@pasteur.fr)


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Nos travaux ont pour objectif une meilleure compréhension du fonctionnement de la cellule fongique afin d'élaborer des stratégies de contrôle de la croissance chez les champignons pathogènes. Nous nous intéressons en particulier à décrypter les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation de biofilms par la levure pathogène, Candida albicans, à l'aide d'approches génomiques et génétiques. Par ailleurs, nous poursuivons l'étude détaillée d'un processus clef dans la biologie des champignons filamenteux, la germination des spores, et une recherche exhaustive de gènes essentiels à la croissance du champignon pathogène Aspergillus fumigatus.



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Candida albicans : génomique, biofilms et épidémiologie (S. Aubert, M.-E. Bougnoux, F. Cottier, S. Garcia-Sanchez, S. Goyard, P. Knechtle et C. d'Enfert)

Candida albicans est actuellement le principal pathogène fongique humain. En particulier, C. albicans est responsable d'infections systémiques chez des patients présentant un déficit immunitaire important et recevant une antibiothérapie à large spectre. Les candidoses systémiques sont associées à une forte mortalité malgré la disponibilité de traitements. Il est donc nécessaire de mieux comprendre l'épidémiologie des candidoses et la physio-pathologie de ces infections et de définir de nouvelles cibles thérapeutiques si l'on veut à terme être en mesure de réduire l'incidence et les conséquences de ces infections. Les projets que nous développons s'inscrivent donc à la fois dans une recherche en épidémiologie et dans une étude de processus liés aux infections à l'aide d'outils de génomique.

a. Outils pour l'analyse génomique chez Candida albicans [S. Garcia-Sanchez, S. Goyard, P. Knechtle et C. d'Enfert]

C. albicans est une levure diploïde stricte et de fait, son étude par les techniques de la génétique réverse est relativement fastidieuse. Depuis quelques années, une ébauche de la séquence du génome est disponible grâce au travail de séquençage réalisé par le Stanford Genome Technology Center. Nous avons développé des outils d'analyse du génome permettant d'aborder différents aspects de la biologie de C. albicans par des approches globales (étude du transcriptome et du protéome): une base de données, CandidaDB, et des puces à ADN permettant une étude simultanée de l'état transcriptionnel de la quasi-totalité des gènes de C. albicans. Nous participons actuellement à la ré-annotation du génome de C. albicans sur la base d'une nouvelle version de cette séquence rendue publique par le Stanford Genome Technology Center en Mai 2002, dans le cadre d'une collaboration internationale impliquant plusieurs groupes. Ce travail va permettre la diffusion d'une nouvelle version de CandidaDB début 2004.

La comparaison du génome de C. albicans aux génomes d'ascomycètes pathogènes ou saprophytes a permis d'identifier certains gènes qui semblent typiques d'ascomycètes pathogènes et/ou capables de former des hyphes (Collaboration P. Philipsen, U. Bâle) et dont on peut penser qu'ils jouent un rôle important dans la biologie de ces organismes. L'étude de trois de ces gènes, deux codant des phospholipases et un codant un facteur d'échange, est en cours.

Notre groupe a par ailleurs été impliqué dans diverses collaborations pour l'utilisation des puces à ADN de C. albicans que nous avons conçues (J.. Pla, U. Madrid ; A. Mitchell, Columbia U., New York ; J. Perez-Martin, U. Madrid).

b. Formation de biofilms par Candida albicans [S. Aubert, F. Cottier, S. Garcia-Sanchez, S. Goyard et F. Mateen]

Les biofilms sont des communautés de micro-organismes qui se développent en association avec une surface (Photo 1). Ils constituent un environnement protégé au sein duquel les micro-organismes adoptent une physiologie particulière. Dans le cas des levures pathogènes telles Candida albicans, la formation de biofilms a été observée sur différents implants médicaux (prothèses, catheters) et est responsable de certaines pathologies (stomatites). Les levures présentes au sein du biofilm développent une résistance accrue aux antifongiques et peuvent donc constituer une source de ré-infection après le traitement apparemment efficace d'une candidémie. Etant donnée l'importance croissante des infections à Candida en santé humaine et la mortalité importante qui leur est associée, une meilleure compréhension de la formation des biofilms en vue de développer des moyens de détection ou de prévention s'avère nécessaire.

Nous avons démarré en 2001 un projet d'étude des biofilms de C. albicans dans le cadre d'un Programme Transversal de Recherche en collaboration avec l'Unité de Mycologie Moléculaireet le Groupe de Génétique des Biofilms. Les objectifs de ce PTR sont de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des biofilms par les levures pathogènes, comprendre la physiologie de ces levures lorsqu'elles sont impliquées dans des biofilms et de proposer des stratégies de détection des biofilms et de prévention de leur formation. Dans cette optique, notre groupe a mis en place différents modèles de biofilm pour Candida albicans et entrepris l'identification de gènes exprimés au sein du biofilm mature. Nous avons ainsi étudié à l'aide de puces à ADN le transcriptome de biofilms et de cultures planctoniques obtenus dans des conditions d'aération, d'agitation et de nutriments variées et par des souches de C. albicans présentant des différences dans leur capacité à effectuer la transition levure-hyphe. Pris dans leur ensemble, nos résultats suggèrent que la formation de biofilms par C. albicans constitue un processus développemental associé à l'expression de fonctions particulières, par exemple le métabolisme des acides aminés. De façon plus importante, il apparaît que le transcriptome adopte un état spécifique dans le biofilm qui n'est que peu influencé par les conditions environnemmentales.

Cette approche nous a permis d'identifier un grand nombre de gènes dont l'expression est augmentée dans les biofilms. Nos travaux actuels ont pour objectif d'évaluer le rôle de plusieurs de ces gènes dans la formation de biofilms par construction et analyse de souches présentant des mutations nulles pour l'un ou l'autre de ces gènes. Nous nous sommes en particulier intéressés aux gènes PGA59 et PGA62 qui codent deux protéines homologues ayant des signaux de modification par une ancre glycosyl phosphatidylinositol (GPI) et dont nous avons confirmé la localisation à la surface des cellules de C. albicans (Photo 2). Des souches de C. albicans mutées pour le gène PGA62 sont affectées dans leur capacité à former un biofilm mais aussi dans leur capacité à former des hyphes en culture planctonique. Ce défaut de mycéliation pourrait être à l'origine du défaut de formation du biofilm.

d. Typage moléculaire de C. albicans [M.-E. Bougnoux et C. d'Enfert]

La technique de Multi Locus Sequence Typing (MLST) mise au point dans notre laboratoire permet un typage reproductible et extrêmement discriminant des souches de C. albicans. Cette méthode est basée sur le séquençage de six loci indépendants qui présentent des variations intra-spécifiques. En collaboration avec le groupe de F. Odds (U. Aberdeen, Ecosse) qui a mis au point une méthode similaire, nous avons repris le typage de 90 souches de C. albicans sur dix loci et abouti à une méthode consensuelle faisant appel à sept loci. Par ailleurs, une base publique pour les données de typage de C. albicans par MLST ( http://calbican.mlst.net) a été mise en place en collaboration avec le groupe de B. Spratt (Imperial College, Londres).

La technique de MLST a été appliquée à l'étude de différentes collections de souches infectieuses et commensales dans le cadre d'une collaboration avec la Plate-forme Génomique de la Génopole Institut Pasteur.Cette étude nous a en particulier permis de comparer la méthode de typage par MLST à une méthode de typage par empreinte (sonde Ca3) couramment utilisée. Les résultats obtenus montrent que le typage par MLST aboutit à une séparation des souches de C. albicans en cinq grands groupes similaires à ceux identifiés à l'aide de la sonde Ca3. De façon remarquable, nos résultats indiquent des événements de recombinaison entre ces groupes, suggérant que les phénomènes de sexualité qui ont été récemment observés au laboratoire pour C. albicans peuvent aussi se dérouler dans l'environnement. D'un point de vue plus épidémiologique, l'étude d'un grand nombre d'isolats d'origine commensale, clinique ou animale suggère que les souches responsables d'infections invasives n'appartiennent pas à un groupe génétique distinct. De plus, le typage de souches obtenues à partir de plusieurs services de réanimation français a permis de mettre en évidence des transmissions noscomiales intra-hospitalière et, de façon plus inattendue, inter-hospitalière.

Germination des spores chez Aspergillus nidulans (A. Lafon, M.K. Chaveroche et C. d'Enfert)

Les champignons filamenteux du genre Aspergillus sont connus tant pour leurs applications biotechnologiques que pour les pathologies dont ils sont responsables. La germination des spores (conidies) représente une étape clef dans le cycle de développement du champignon et constitue la première étape dans la colonisation d'un nouvel environnement. Les recherches effectuées visent la caractérisation des évènements moléculaires et biochimiques intervenant au cours des phases précoces de la germination et en particulier la compréhension du signal déclenchant le processus germinatif et sa transduction au niveau cellulaire.

Nos travaux chez le champignon modèle Aspergillus nidulans ont abouti à la mise en évidence du rôle de la signalisation par l'AMPc lors de l'initiation de la germination. Nos travaux ont aujourd'hui pour objectif de mieux comprendre les voies d'activation de l'adénylate cyclase et de préciser la nature des cibles de l'AMPc lors de la germination. Dans cette optique, nous nous intéressons plus particulièrement aux protéines G hétérotrimériques et aux récepteurs qui les contrôlent. Nous avons ainsi pu montrer que des trois sous-unités Gα connues chez A. nidulans, seule GanB intervient dans le contrôle des étapes précoces de la germination (Collaboration K.-Y. Jahng, Corée du Sud). Le rôle de protéines Gβ et Gγ ainsi que d'un facteur d'échange du GTP pour la protéine GanB dans le contrôle de la germination a aussi pu être démontré (Collaboration J. Yu, U. Wisconsin, USA).

L'analyse d'une collection d'ESTs (Expressed Sequence Tags), réalisée en collaboration avec la plate-forme génomique de la Génopole Institut Pasteur devrait permettre de disposer prochainement d'un outil d'analyse du transcriptome de A. nidulans et d'aboutir à une caractérisation de différentes souches mutantes affectées dans la voie de signalisation AMPc.

Identification de gènes essentiels chez le champignon pathogène Aspergillus fumigatus (L. Simon et C. d'Enfert)

Aspergillus fumigatus est actuellement le principal champignon filamenteux pathogène de l'homme, responsable d'infections systémiques fatales (aspergillose invasive) chez le patient immuno-déprimé, infections pour lesquelles on ne dispose pas de traitement à la fois efficace et avec peu d'effets secondaires. Les approches de génétique réverse ciblées sur différentes protéines dont on pouvait postuler une implication dans le processus infectieux ne s'étant pas révélées fructueuses, il nous a semblé nécessaire de développer de nouvelles stratégies plus exhaustives permettant l'identification de gènes essentiels à la croissance du champignon en culture ou uniquement lors de la colonisation de l'hôte. Ce programme de recherche a été réalisé en partenariat avec Bayer CropScience.

Nous avons ainsi mis au point une méthode d'identification de gènes essentiels chez A. fumigatus couplant mutagenèse insertionnelle par un transposon sur des souches diploïdes et haploïdisation par génétique parasexuelle. Ceci nous a permis dans une étude préliminaire d'identifier 29 régions génomiques essentielles à la croissance de A. fumigatus. Les gènes identifiés codent des fonctions impliquées dans de nombreux processus cellulaires et certains sont spécifiques de A. fumigatus. Nos travaux sont actuellement orientés vers la robotisation de cette méthode en vue de l'appliquer de façon exhaustive pour établir un catalogue de cibles pour cet organisme.

Légendes:

1: Biofilm de Candida albicans formé sur un support plastique (Microscopie électronique à balayage ; collaboration E. Arbeille, Université de Tours)

2: Localisation à la surface des cellules de Candida albicans d'une protéine hybride Pga59-GFP (Microscopie confocale, Cente d'Imagerie Dynamique, Institut Pasteur)

Mots-clés: Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, AMPc, kinase, transduction du signal, germination, spore, conidie, antifongique, cible, transposon, puce à ADN, biofilm, épidémiologie, Multi-Locus Sequence Typing, génomique, transcriptome



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Thepaut, Sylvana (sthepaut@pasteur.fr) Bougnoux, Marie-Elisabeth, Université Paris Ile de France Ouest (Maître de Conférence/Praticien Hospitalier, bougnoux@pasteur.fr)

d’Enfert, Christophe, Institut Pasteur (Chef de Laboratoire, denfert@pasteur.fr)

Goyard Sophie, Institut Pasteur (Chargée de recherche, goyard@pasteur.fr)
Cottier, Fabien (DEA)

Garcia-Sanchez, Susana (stagiaire post-doctorale)

Knechtle, Philipp (stagiaire post-doctoral, knechtle@pasteur.fr)

Lafon, Anne (doctorante, alafon@pasteur.fr)

Mateen, Farrah (Maîtrise)

Simon, Laurence (stagiaire post-doctorale, lsimon@pasteur.fr)
Aubert, Sylvie (technicienne, syaubert@pasteur.fr)

Chaveroche, Marie-Kim (technicienne, mkchaver@pasteur.fr)

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