Portail IP   bandeau_genéral
imprimer
Imprimer
     Bactériologie Moléculaire et Médicale


  Responsable : Guy BARANTON (gbaran@pasteur.fr)


  resume

 

La possibilité d'inactiver des gènes chez Leptospira ouvre la voie à l'étude de leurs fonctions. La participation des récepteurs "Toll-like" dans les réponses d'immunité innée générées par les leptospires ou par le lipopolysaccharide est en cours d'étude. Chez Borrelia, l'analyse du gène ospC confrontée à la phylogénie du genre permet de distinguer trois populations bactériennes distinctes : invasive, cutanée et non infectieuse pour les vertébrés. Chez les Yersinia, l'analyse de déterminants chromosomiques et leur comparaison chez les différentes espèces pathogènes ont ouvert une nouvelle voie d'approche vers une meilleure compréhension des mécanismes responsables du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis.



  rapport

cale

LEPTOSPIRES

Récepteurs "Toll-like"(TLRs) et lipopolysaccharide (LPS) des leptospires (C. Werts, E. Fournié-Amazouz, M-A. Nahori et I. Saint Girons).

Les pathogènes bactériens activent le système d'immunité innée de l'hôte via les récepteurs "Toll-like" qui reconnaissent des composants conservés des bactéries ou PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) (LPS, peptidoglycane, lipoprotéines, ADN ...). Nous avons montré que le LPS de Leptospira interrogans active les macrophages via les récepteurs CD14 et TLR2, contrairement aux LPS des entérobactéries qui utilisent TLR4 (Werts et al., 2001). La structure du lipide A du LPS de L. interrogans a été déterminée par le groupe de C.R.H. Raetz (Université Duke, Durham, USA) (Que et al., en préparation). Nous étudions à présent les relations entre la structure et les fonctions de ce lipide A particulier, qui n'est pas endotoxique et qui ne présente pas le même usage des TLRs que le LPS entier. Ces données apportent de nouvelles informations concernant la réponse immunitaire innée pendant l'infection par Leptospira. Par ailleurs, nous nous intéressons au pouvoir inflammatoire éventuel d'autres PAMPs telles les protéines de choc thermique, qui constituent avec le LPS les antigènes majoritairement reconnus par l'hôte infecté par Leptospira et possèdent chez d'autres bactéries (Helicobacter pylori) un pouvoir inflammatoire.

Caractérisation des voies de biosynthèse d'acides aminés et de l'hème chez les leptospires (M. Picardeau, R. Guégan, H. Bauby et I. Saint Girons).

Contrairement aux spirochètes Borrelia burgdorferi et Treponema pallidum, les leptospires possèdent les gènes codant pour les enzymes de biosynthèse de la plupart des acides aminés et de l'hème. Récemment, le développement d'outils génétiques nous a permis l'inactivation ciblée de certains gènes chez les leptospires saprophytes. Ainsi dans une étude précédente, nous avons montré que l'inactivation du gène trpE de L. meyeri entraînait l'auxotrophie pour le tryptophane. La biosynthèse de la méthionine est une voie centrale du métabolisme bactérien car cet acide aminé contrôle de nombreux processus cellulaires. Nous avons donc étudié la biosynthèse de la méthionine chez les leptospires. Nos résultats, notamment l'analyse du phénotype de différents mutants chez L. meyeri, montrent que la biosynthèse de la méthionine chez les leptospires est beaucoup plus complexe que précédemment suggéré ; il existerait deux voies distinctes : la voie de transsulfuration de type entérobactérie et la voie de sulfhydrylation.

L'hème est un dérivé tétrapyrolle couramment utilisé comme groupe prosthétique de certaines protéines telles que les cytochromes, catalases, péroxydases. L'analyse de la séquence du génome de L. interrogans montre que tous les gènes de biosynthèse de l'hème, excepté hemD absent du génome, sont regroupés dans une région de 15 kb du petit chromosome CII. Le gène hemC de L. interrogans est capable de complémenter un mutant ΔhemD d'Escherichia coli, suggérant que le gène hemC de L. interrogans code pour une enzyme bifonctionnelle. De plus, les mutants hemH de L. biflexa résultant d'un échange allélique ne sont identifiés que lorsque le milieu est supplémenté en hème, suggèrant que l'hème est un facteur de croissance essentiel pour les leptospires et que ces spirochètes sont capables de synthétiser ou d'utiliser l'hème exogène. Ces résultats devraient permettre de mieux comprendre la pathogenèse des leptospires.

Locus toxine-antitoxine chromosomique de Leptospira interrogans (M. Picardeau, S. Ren et I. Saint Girons).

Les systèmes toxine-antitoxine codés par les plasmides et chromosomes bactériens sont constitués d'une toxine qui inhibe la croissance cellulaire et d'une antitoxine spécifique de la toxine. Nous avons étudié le gène chpK d'un locus toxine-antitoxine de L. interrogans dans des systèmes procaryotes et eucaryotes. Le clonage du gène de spirochète chpK dans un vecteur d'expression de mycobactéries entraîne une réduction spectaculaire de l'efficacité de transformation chez Mycobacterium smegmatis et M. bovis BCG, suggérant que la protéine ChpK de L. interrogans est hautement toxique pour les mycobactéries. La présence du gène chpK de L. interrogans inhibe aussi la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces résultats montrent que ChpK possède un large spectre d'hôte et que la cible de cette toxine est conservée chez les procaryotes et eucaryotes.

CNR et CCOMS des Leptospires

Voir le site web CNR des Leptospires :

http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/lepto-index.html

D. Postic et G. Baranton en collaboration avec l'Institut de Veille Sanitaire (InVS) : Leptospirose et canicule.

La canicule qui a sévi en métropole de juin à septembre a entraîné des contacts plus fréquents et prolongés avec les eaux douces. L'expérience passée d'années chaudes était contrastée: en 1947 et 1949, le nombre de cas avait doublé par rapport à la moyenne de l'époque. En 1976, c'était l'inverse. Il était donc difficile d'estimer le risque actuel. Cependant dès août, il était clair que l'augmentation des cas détectés était modeste et localisée à trois régions (Aquitaine, Poitou-Charentes et Champagne-Ardennes), ce qui se confirmait en septembre malgré un accroissement considérable des demandes d'examens (lié à des bulletins d'alerte relayés par la presse, sans pondération ni conseils de conduite à tenir). En octobre et novembre, le nombre de cas devenait inférieur aux moyennes habituelles. En conclusion, la population a considérablement accru les contacts avec des eaux plutôt moins contaminées que les années précédentes. Une hypothèse est que l'absence presque totale de pluies estivales d'orage (sauf dans certaines régions du Sud-Ouest) n'a pas permis le lessivage des sols contaminés par les urines et les leptospires sont morts sans avoir été entraînés dans les cours d'eau.

En liaison avec l'InVS, le CNR se documente et va évaluer des systèmes d'alerte afin de répondre aux phénomènes météorologiques extrêmes (canicule, crues, inondations) qui pourraient devenir plus fréquents et modifier le profil épidémiologique de la leptospirose dans notre pays.

Consulter également : http://www.pasteur.fr/recherche/Leptospira/LeptospiraF.html

BORRELIA

Voir : http://www.pasteur.fr/recherche/borrelia/Welcomefr.html

Des Borrelia au Maroc (M. Sarih, F. Jouda, L. Gern et D. Postic).

Dans le cadre du projet européen (associant 7 partenaires et coordonné par D. Postic) destiné à évaluer le risque de maladie de Lyme sur le pourtour méditerranéen, après la Tunisie, c'est le Maroc qui est étudié. Là encore, les taux d'infestation des tiques sont très élevés: 48% et l'espèce très majoritaire est B. lusitaniae non pathogène pour l'homme. Cependant 3 B. garinii ont été identifiées et 3 B. burgdorferi sensu stricto (espèce jamais identifiée en Afrique).

ospC et pathogénicité de Borrelia (V. Lagal, E. Ruzic-Sabljic, D. Postic et G. Baranton).

Les études par SSCP-PCR d'amplicons du gène ospC de 80 souches de Borrelia isolées d'humains, notamment en Slovénie où la maladie est particulièrement fréquente et grave, ont montré de nombreux génotypes correspondant au phénotype invasif. Le gène ospC code une protéine de membrane externe et peut donc être considéré comme un marqueur du potentiel pathogénique d'une souche donnée. Le report de ce marqueur sur des arbres phylogénétiques réalisés auparavant par AP-PCR ou VNTR montre que chaque phénotype (invasif, cutané ou non infectieux) est associé à certains clones. Il semble que les clones non infectieux soient en position ancestrale.

CNR Borrelia (D. Postic, E. Ferquel et C. Pérez-Eid).

Voir le site web CNR des Borrelia :

http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/borrelia-index.html

La borréliose de Lyme, la plus fréquente des maladies à vecteurs en Europe comme en Amérique du Nord, fait l'objet de deux axes de recherche : l'un concerne le vecteur et les bactéries pathogènes transmises, l'autre l'incidence humaine de la maladie en France.

En Europe, I. ricinus, la tique vectrice de la borréliose de Lyme, transmet les trois espèces pathogènes du complexe B. burgdorferi, responsables des cas humains. Chacune de ces trois espèces semble associée à des manifestations cliniques différentes, d'où l'intérêt d'en connaître les distributions respectives. Une telle approche ne peut s'effectuer qu'à partir des tiques. En 2002, nous avons pratiqué des collectes de tiques, d'une part, en Bretagne et, d'autre part, dans le centre de la France (département de l'Allier). Les collectes sont faites sur des bases statistiques strictes, selon la méthode mise au point antérieurement par notre équipe, qui permet une évaluation de la densité des tiques. La recherche des bactéries chez les tiques se fait par PCR.

L'incidence humaine de la borréliose de Lyme en France est actuellement inconnue puisque les chiffres fluctuent, d'après deux études anciennes, entre 16,4 et 40 cas pour 100 000 habitants. Notre objectif est, d'une part, de réduire cette trop large fourchette afin de donner une idée plus exacte de la situation en France et, d'autre part, de mettre en évidence d'éventuelles différences régionales, au niveau incidence et tableau clinique. Ce travail est mené selon deux approches : une étude rétrospective à partir de demandes de sérodiagnostics parvenues au laboratoire Pasteur Cerba, l'un des deux plus importants laboratoires français, et une étude prospective s'appuyant sur un réseau de surveillance constitué de médecins libéraux et hospitaliers, généralistes et spécialistes et de biologistes.

YERSINIA (Responsable : E. Carniel)

Le genre Yersinia comprend trois espèces pathogènes pour l'homme : les espèces entéropathogènes, Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica, et l'agent de la peste, Y. pestis.

Les principaux axes de travail du laboratoire des Yersinia sont :

- la caractérisation d'un îlot de pathogénicité qui confère aux souches qui l'hébergent la capacité de provoquer des infections systémiques chez l'homme et l'animal ;

- les bases moléculaires du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis. Pour cela, le séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis, bactérie "jumelle" mais de virulence bien moindre vient d'être achevé. Une analyse de génomique fonctionnelle comparative est maintenant en cours ;

- la physiopathologie de l'infection à Yersinia ;

- l'évolution de Y. pestis depuis son apparition récente à partir de Y. pseudotuberculosis ;

- la résistance aux antibiotiques et l'évaluation de nouveaux traitements ;

- la santé publique (Centre National de Référence et Centre Collaborateur de l'OMS).

Les travaux ayant fait l'objet de publications en 2003 sont les suivants :

Présence de l'îlot de haute pathogénicité chez les sous-espèces III et VI de Salmonella enterica (Contributeur : E. Carniel - Collaborateurs : T.A. Oelschlaeger, D. Zhang, S. Schubert, W. Rabsch, H. Karch, et J. Hacker).

Le genre Salmonella peut être divisé en huit groupes mais la majorité des salmonelles pathogènes pour l'homme et les animaux appartient au groupe I. L'analyse de 74 souches de Salmonella à la recherche de l'îlot de haute pathogénicité (HPI), initialement décrit chez les Yersinia, a montré que les salmonelles des groupes IIIa, IIIb et VI hébergent cet îlot. La majorité des isolats HPI+ produisent la yersiniabactine et les protéines de haut poids moléculaire HMWP1 et HMWP2 dans des conditions de carence en fer. Cependant, seules les souches du groupe VI portent un HPI identique à celui des Yersinia, avec notamment la présence du gène codant une intégrase en aval de ybtS et un site d'insertion dans un gène asn tRNA. Les souches des groupes IIIa et IIIb possèdent par contre plusieurs gènes (int, ybtS, région intergénique ybtP-ybtA, irp1) portant des insertions ou des délétions. Leur HPI n'est pas inséré dans un gène asn tRNA mais en aval de ych. L'HPI est donc un îlot de pathogénicité ubiquitaire, présent chez de nombreux membres de la famille des Enterobacteriaceae.

Etude des relations entre virulence bactérienne et métabolisme des nucléotides (Contributeurs : V. Chenal-Francisque, J. Foulon et E. Carniel - Collaborateurs : H. Munier-Lehmann, M. Ionescu, P. Christova, et O. Bârzu).

Les "nucleoside monophosphate kinases" (NMPKs) sont des catalystes essentiels pour la croissance et la multiplication bactérienne. Ces enzymes sont très conservées parmi les membres de la famille des Enterobacteriaceae à laquelle Y. pestis appartient. Cependant, il avait été précédemment montré que la thymidylate kinase de Y. pestis (TMPKyp) possédait des propriétés biochimiques différentes de celles de Escherichia coli. Nous avons donc décidé de voir si cela était aussi le cas pour une autre NMPK, l'adénylate kinase (AK). Comme pour la TMPKyp, l'AKyp a une stabilité thermodynamique plus faible que celle des autres AKs étudiées. Deux mutations (S129F et P87S), qui avaient précédemment été décrites comme induisant un défaut de croissance thermosensible chez E. coli, ont été introduites dans l'AKyp. Les protéines recombinantes se sont révélées être moins stables que la protéine parentale et posséder une plus grande sensibilité à une protéolytise. Quand la substitution P87S a été introduite dans le gène adk chromosomique de Y. pestis, la croissance de la souche mutante à la température non permissive de 37°C a été profondément altérée. Dans le modèle expérimental murin, alors que 50 CFU de la souche sauvage de Y. pestis a tué 100% des animaux après injection par voie sous-cutanée, une dose de 1.5 x 104 CFU du mutant adk n'a tué aucun animal. L'ADK est donc également essentielle à la multiplication de Y. pestis in vivo.

Détection de Yersinia pestis dans les expectorations humaines par PCR en temps réel (Contributeur : F. Guinet - Collaborateurs : C. Loïez, S. Herwegh, F. Wallet, S. Armand et R.J. Courcol).

Un test de détection par PCR en temps réel (RT-PCR) du gène codant l'activateur du plasminogène (pla) de Yersinia pestis dans des échantillons d'expectorations humaines a été développé. Un contrôle positif interne a été ajouté au mélange réactionnel afin de détecter la présence d'inhibiteurs de la réaction PCR potentiellement présents dans les échantillons biologiques. Ce test a une spécificité pour Y. pestis de 100%. En l'absence d'inhibiteurs, une sensibilité de 102 CFU/ml de fluide bronchique a été obtenue. En présence d'inhibiteurs, la détection de Y. pestis a nécessité un temps de traitement des échantillons plus long et une concentration initiale de bactéries d'au moins 104 CFU/ml. Le temps total pour effectuer le test est de moins de 5 h. Ce test RT-PCR est donc adapté au diagnostic rapide de la peste pulmonaire, la forme clinique la plus probable en cas d'attaque bioterroriste.

Développement et validation d'un test de diagnostic rapide de la peste en bandelette (Contributeurs: J. Foulon et E. Carniel - Collaborateurs : S. Chanteau, L. Rahalison, L. Ralafiarisoa, M. Ratsitorahina, et L. Ratsifasoamanana).

La peste est une maladie aiguë, mortelle en quelques jours en l'absence d'un traitement approprié et précoce. Le diagnostic, tel qu'il est classiquement fait, nécessite un laboratoire correctement équipé et à proximité des cas suspects, ce qui est rarement le cas dans la réalité du terrain. Dans ces conditions "optimales", la confirmation du diagnostic de peste n'est obtenue qu'au bout d'une semaine, c'est-à-dire trop tardivement pour la mise en place de mesures thérapeutiques et prophylactiques efficaces. Le diagnostic très rapide de cette maladie est donc capital. Nous avons développé un test de diagnostic rapide de la peste basé sur la détection de l'antigène F1 par la méthode d'immunochromatographie. Ce test donne un résultat en moins de 15 min. Son seuil de détection est de 0.5 ng/ml et sa durée de conservation est d'au moins 21 jours à 60°C. Sa sensibilité et spécificité sont de 100%. Le test bandelette a permis de détecter 41.6% d'échantillons positifs de plus que la bactériologie et 31% de plus que la technique ELISA. Après avoir été distribué aux agents de santé dans 26 sites pilotes périphériques de Madagascar, la concordance entre les résultats obtenus sur le terrain et au laboratoire central a été de 89.8%. Ce test va être extrêmement précieux aux programmes de lutte contre la peste dans les pays endémiques.

Utilisation du locus codant l'antigène O pour le sérotypage de Yersinia pseudotuberculosis (Contributeur : E. Carniel - Collaborateurs : T. Bogdanovich, H. Fukushima et M. Skurnik).

L'espèce Y. pseudotuberculosis est classiquement subdivisée en 6 sérotypes (I à VI) en Europe. Un nombre plus élevé de sérotypes et sous-sérotypes (une vingtaine) a été défini à partir d'isolats asiatiques. L'obtention de sérums spécifiques des nouveaux sérotypes et sous-sérotypes n'est ni très aisée ni très fiable du fait de nombreuses réactions croisées entre sérotypes. Nous avons donc évalué la possibilité de distinguer les différents sérotypes par une approche génétique basée sur la discrimination des 21 géno-sérotypes par PCR multiplex. Cette PCR multiplex est composée de 9 PCR spécifiques en une seule réaction et permet la distinction de 14 sérotypes individuels et de deux sérotypes groupés (O:4a-O:8 et O:12-O:13). L'identification des sérotypes O:7, O:9, et O:10 nécessite des PCR additionnelles. Une très bonne corrélation entre les résultats de sérotypage classique et par PCR a été obtenue à partir d'isolats de Y. pseudotuberculosis d'origines variées. Le géno-sérotypage s'est aussi révélé utile au typage des souches devenues auto-agglutinables. Ce test possède également l'avantage de pouvoir être utilisé par tous les laboratoires, sans nécessiter la préparation fastidieuse et délicate de nombreux antisérums spécifiques.

Mise au point d'une méthode rapide et simple d'inactivation des gènes chromosomiques chez les Yersinia (Contributeurs: A. Derbise, B. Lesic, D. Dacheux et E. Carniel - Collaborateur : J.M. Ghigo).

La méthodologie classiquement utilisée chez les Yersinia pour inactiver des gènes chromosomiques nécessite plusieurs étapes de sous-clonage dans un vecteur suicide puis l'introduction de ce vecteur successivement dans deux souches de E. coli puis dans la souche de Yersinia à mutagéniser. Cette méthode, assez longue et lourde, est très limitante à l'ère de la génomique fonctionnelle et des mutagenèses à grande échelle. Pour éviter d'avoir à utiliser cette approche, nous avons testé et optimisé pour les Yersinia une technique d'inactivation de gènes chromosomiques qui ne nécessite aucune étape de clonage et peut être effectuée directement dans la souche de Yersinia choisie. Cette technique est basée sur l'expression de l'opéron red du phage lambda porté par le plasmide pKOBEG. Ce plasmide permet la recombinaison entre la région chromosomique à mutagéniser et un produit PCR portant une cassette de résistance à un antibiotique flanquée par les régions homologues cibles. La construction d'un vecteur pKOBEG-sacB couplée à l'utilisation d'une PCR en trois temps (de façon à générer des séquences flanquantes de 500 pb de part et d'autre de la cassette de résistance) nous a permis d'obtenir des échanges alléliques efficaces, aussi bien chez Y. pestis que chez Y. pseudotuberculosis.

Centre National de Référence des Yersinia et Centre Collaborateur de l'OMS (L. Martin, A. Leclercq, F. Guinet et E. Carniel)

Voir le site web CNR des Yersinia :

http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/yersinia-index.html

Mots-clés: Spirochètes, Leptospira, Borrelia, TLR, lipide A, LPS, échange allélique, épidémiologie, phylogénie, VNTR, ospC, Yersinia, génomique, virulence



  publications

puce Toutes les publications 2003 sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  COUEILLE Solange coueille@pasteur.fr

DELARUE Nadine ndelarue@pasteur.fr
BARANTON Guy IP Chef d’Unité gbaran@pasteur.fr

POSTIC Danièle IP Médecin dpostic@pasteur.fr

SAINT GIRONS Isabelle IP Chef de laboratoire isgirons@pasteur.fr

CARNIEL Elisabeth IP Chef de laboratoire carniel2@pasteur.fr

FERQUEL Elisabeth IP Médecin eferquel@pasteur.fr

PEREZ-EID Claudine IP Chef de laboratoire cperez@pasteur.fr

CHAUVAUX Sylvie IP Chargée de recherche chauvaux@pasteur.fr

GUINET Françoise IP Chargée de recherche fguinet@pasteur.fr

PICARDEAU Mathieu IP Chargé de recherche mpicard@pasteur.fr

WERTS Catherine IP Chargée de recherche cwerts@pasteur.fr
BOMMEZZADRI Simona Thèse sbommezz@pasteur.fr

DERBISE Anne Post doctorante aderbise@pasteur.fr

GIUSTINIANI Julien Maîtrise

HOAREAU Laurence DEA

LAGAL Vanessa Thèse vlagal@pasteur.fr

LESIC Biliana Thèse blesic@pasteur.fr

POUILLOT Flavie DEA pouillot@pasteur.fr
BELLENGER Elisabeth Technicienne ebellen@pasteur.fr

BOURHY Pascale Technicienne pbourhy@pasteur.fr

CHENAL Viviane Technicienne vchenal@pasteur.fr

DENIS Patrick Agent de laboratoire denis@pasteur.fr

DESNOUES Nicole Technicienne CRBIP

DJELILI Anissa Ingénieur Qualité

FAVRE Denise Détachée Centre médical defavre@pasteur.fr

FOULON Jeannine Technicienne jfoulon@pasteur.fr

FOURNIE Edith Technicienne serpu@pasteur.fr

GALUPA Isabel Agent de laboratoire galupa@pasteur.fr

GARNIER Martine Technicienne mgarnier@pasteur.fr

GUINANDIE Françoise Agent de laboratoire guinandi@pasteur.fr

MARTIN Liliane Technicienne limartin@pasteur.fr

NAHORI Marie-Anne Ingénieur manaho@pasteur.fr

SERTOUR Natacha Technicienne nsertour@pasteur.fr

TATOT Véronique Aide de laboratoire tatot@pasteur.fr

WISZNIOWSKI Karine Aide de laboratoire kwisznio@pasteur.fr

Rapports d'activité 2003 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr