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     Biochimie Microbienne


  Responsable : Patrick TRIEU-CUOT (ptrieu@pasteur.fr)


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L'Unité de Biochimie Microbienne étudiait la régulation de l'expression génétique chez les bactéries Gram-positives modèles (Bacillus, Streptomyces) ainsi que l'étude des facteurs de virulence et à leur expression chez des bactéries pathogènes (Listeria, Streptocoques, Staphylocoques). Cette Unité a été fermée le 31 décembre 2003.



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Réponse à l'environnement chez les bactéries pathogènes Gram-positives

(T. Msadek, A. Chastanet, S. Dubrac, J. Fert, C. Cyncynatus, J. Bignon, M. Débarbouillé et B. Fournier)

Les travaux de recherche concernent la réponse aux stress et la transmission de signaux par les systèmes à deux composants chez des bactéries pathogènes à Gram-positif (Listeria monocytogenes et Staphylococcus aureus).

L'analyse du génome complet de L. monocytogenes a révélé la présence de plusieurs nouvelles ATPases Clp. L'une d'elles présente de fortes similitudes avec la protéine ClpB de E. coli, mais est absente chez la bactérie Gram-positive modèle, Bacillus subtilis. Un mutant d'inactivation du gène clpB de L. monocytogenes a été construit et la virulence de ce mutant est fortement diminuée dans un modèle murin d'infection (collaboration avec S. Naïr-Bedouelle, Faculté de Médecine Necker-Enfants Malades). De façon intéressante, cet effet ne semble pas dû à un défaut de résistance aux stress. C'est le premier exemple d'un rôle pour une ATPase ClpB dans la virulence chez une bactérie à Gram positif.

Alors que le régulateur de réponse DegU est présent chez L. monocytogenes, le gène codant pour la kinase associée DegS est absent. Le régulateur DegU est particulièrement intéressant, car extrêmement pléiotrope, contrôlant la synthèse d'enzymes exocellulaires (protéases, saccharases,a-amylase) ainsi que la motilité et la compétence pour la transformation par de l'ADN exogène chez B. subtilis. Un mutant degU de L. monocytogenes a été construit afin de démontrer que DegU régule négativement sa propre synthèse. Une analyse du transcriptome du mutant degU de L. monocytogenes a été réalisée. Nous avons ainsi identifié 22 gènes dont l'expression est contrôlée par DegU chez L. monocytogenes. Parmi les gènes dont l'expression est activée, on retrouve plusieurs gènes impliqués dans le transport et le métabolisme de sucres, ainsi que des gènes  codant deux régulateurs de l'activité du facteur sigma alternatif sigma B. Des expériences de retard de migration sur gel et d'empreinte à la DNase I ont permis de montrer une fixation spécifique de la protéine purifiée DegU à une région située en aval du promoteur degU. Cette observation confirme le fait que DegU réprime sa propre synthèse. La virulence du mutant degU, étudiée in vivo dans un modèle murin dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de Pascale Cossart, est  significativement atténuée.

Les bactéries à Gram-positif possèdent un système à deux composants qui se révèle essentiel à la survie de la bactérie, le système YycG/YycF. Des expériences de retard de migration sur gel et d'empreinte à la Dnase I ont permis de montrer une fixation spécifique de la protéine purifiée YycF de S. aureus  à la région régulatrice du gène ssaA, codant un antigène majeur impliqué dans la résistance aux macrolides. Nous avons montré que YycF se fixe également de façon spécifique à la région promotrice de deux autres gènes qui codent pour l'antigène IsaA et la peptidoglycane hydrolase LytM. Ces résultats sont en accord avec le rôle proposé pour ce système dans le contrôle de la virulence et du métabolisme de la paroi.

Le système à deux-composants ArlS/ArlR intervient dans la virulence de S. aureus en réprimant l'expression des gènes de certains facteurs de virulence comme la protéine A et la toxine alpha. Une collaboration avec la plate-forme protéomique de l'Institut Pasteur a montré que la production de 3 protéines cytoplasmiques impliquées dans différentes fonctions physiologiques de la bactérie est régulée par ce système.

Rôle et expression du régulon PlcR chez les bactéries du groupe Bacillus cereus

(D. Lereclus, M. Gominet, V. Sanchis, L. Slamti, J. Brillard, S. Fedhila et C. Nielsen-Leroux)

PlcR est un régulateur pléiotrope qui active la transcription de nombreux gènes de virulence chez les bactéries appartenant au groupe Bacillus cereus. L'analyse de la séquence du génome de B. cereus et du protéome extracellulaire indiquent que plus de 50 gènes sont potentiellement régulés par PlcR. La délétion du gène plcR chez ces bactéries conduit à une diminution du pouvoir pathogène chez l'insecte et la souris, mais aussi dans le cas des endophtalmies. Nous avons montré qu'une métalloprotéase, dont le gène appartient au régulon PlcR, joue un rôle majeur dans la virulence des bactéries vis-à-vis des insectes.

Un gène (papR), lui même régulé par PlcR, spécifie la synthèse d'un peptide de 48 acides aminés portant une séquence signal d'exportation. Une partie du peptide est donc diffusible dans le milieu extracellulaire et peut-être réimportée dans la cellule bactérienne, sous forme d'un pentapeptide (LPFEF), via le système de perméation Opp. Le pentapeptide interagit avec la protéine PlcR permettant ainsi sa fixation sur les séquences d'ADN cible. Il existe une spécificité d'interaction PlcR-PapR. En effet, trois types de pentapeptides (LPFEF, MPFEF, VPFEF) existent chez les bactéries composant le groupe B. cereus. Il est ainsi possible de diviser cette vaste famille bactérienne en trois groupes fondés sur la spécificité des couples PlcR-PapR. Ce système de signalisation moléculaire assure un contrôle spécifique permettant aux bactéries d'un même groupe de produire un ensemble de facteurs de virulence quand leur densité dans le milieu est suffisante (quorum sensing).

Différenciation chez Streptomyces, implication de protéases et de chaperons (P. Mazodier, A. Bellier, C. Lavire)

Les Streptomyces sont des bactéries du sol Gram-positives, filamenteuses. Elles présentent des différentiations remarquables, morphologiques (Hyphes, Sporulation) et physiologiques (production d'antibiotiques). Nous étudions les régulations globales de ces phénomènes.

Les protéases généralement impliquées dans la dégradation des protéines régulatrices sont des protéases ATP-dépendantes, comme les protéines Clp. Chez Streptomyces l'interruption de l'operon clpPclpP2 bloque la différentiation morphologique. La surproduction de ClpX accélère ou active la production antibiotique. Nous avons montré que les activateurs transcriptionnels PopR et ClgR sont impliqués dans la régulation de l'expression de plusieurs gènes clp.

La régulation de la traduction joue un rôle important dans la différentiation des Streptomyces. L'expression des gènes, présentant des codons rares, est régulée au niveau de leur traduction. Celle-ci peut impliquer la disponibilité des tRNAs qui reconnaissent ces codons rares. Chez Escherichia coli la présence de codons rares dans l'ARN messager est suffisante pour recruter le système de marquage par le tmRNA. Ceci nous a incités à étudier le rôle du tmRNA (ssrA) chez Streptomyces.

Mots-clés: Bactéries Gram-positives, expression génétique, facteurs de virulence, réponses au stress, transduction de signal



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FOURNIER Bénédicte Chargé de Recherche IP bfournie@pasteur.fr

KLIER André Professeur Université Paris 7 aklier@pasteur.fr

LERECLUS Didier DR1 INRA lereclus@pasteur.fr

MAZODIER Philippe Chef de Laboratoire IP mazodier@pasteur.fr

MSADEK Tarek Chef de Laboratoire IP tmsadek@pasteur.fr

NIELSEN-LEROUX Christina Chargé de Recherche IP cnielsen@pasteur.fr

RAPOPORT Georges DR1 Emerite CNRS, Pr. IP rapoport@pasteur.fr

SANCHIS Vincent CR1 INRA vsanchis@pasteur.fr

TRIEU-CUOT Patrick Chef de Laboratoire IP ptrieu@pasteur.fr
BELLIER Audrey Etudiante en thèse abellier@pasteur.fr

BRILLARD Julien Chercheur post-doctoral brillard@pasteur.fr

CHASTANET Arnaud Etudiant en thèse achastan@pasteur.fr

CYNCYNATUS Camille Etudiante en DEA ccyncyna@pasteur.fr

DUBRAC Sarah Chercheur post-doctoral sdubrac@pasteur.fr

LAVIRE Céline Chercheur post-doctoral clavire@pasteur.fr

SLAMTI Leyla Etudiante en thèse lslamti@pasteur.fr
ARNAUD Maryvonne Ingénieur de Recherche IP marnaud@pasteur.fr

BIGNON-TOPALOVIC Joëlle Technicienne Supérieure IP jojo@pasteur.fr

FERT Juliette Technicienne Université Paris 7 jfert@pasteur.fr

GOMINET Myriam Technicienne Supérieure IP mgominet@pasteur.fr

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