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     Biologie Moléculaire de l'Expression Génique


  Responsable : Israël Alain (aisrael@pasteur.fr)


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Les projets du laboratoire portent sur l'étude de deux systèmes de signalisation caractérisés par des événements inductibles de protéolyse, aboutissant au transport nucléaire de facteurs de transcription. Le premier projet concerne la famille de facteurs de transcription NF-κB, dont l'activité est contrôlée par des mécanismes de rétention cytoplasmique impliquant des molécules inhibitrices (appelées IκB) dont la dégradation est induite par une variété de signaux. Nous avons identifié plusieurs pathologies causées par des mutations dans un gène codant un composant de cette voie de signalisation (la protéine NEMO). Nous avons en outre identifié une nouvelle deubiquitinase impliquée dans la voie de signalisation NF-κB et responsable d'une pathologie humaine appelée cylindromatose. Nous avons d'autre part mis au point un système permettant de disséquer les diverses étapes de l'activation de NF-κB par le récepteur à l'antigène des cellules T. Parallèlement à ces études nous avons généré des souris où une ou plusieurs des molécules inhibitrices IκB ont été invalidées, ainsi que d'autres où l'activité NF-κB a été spécifiquement inhibée dans certaines régions du cerveau.

Un second projet porte sur le récepteur Notch qui transmet un signal à la suite de 3 étapes de protéolyse et du transport nucléaire de sa région intracellulaire. Nos efforts ont porté dans 2 directions. Nous avons tout d'abord identifié un nouveau mécanisme qui par l'intermédiaire d'une modification post-traductionnelle faisant suite à la seconde étape de protéolyse permet à la troisième d'avoir lieu. D'autre part nous avons montré que de manière semblable à Notch, ses ligands subissaient deux coupures successives, l'une par une métalloprotéase, et la seconde par la γ-secrétase. Néamoins, contrairement à Notch, ces coupures semblent être constitutives.



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Analyse génétique et biochimique des voies d'activation des facteurs de transcription NF-κB (G. Courtois, R. Weil, R. Blaise, C. Lobry, T. Lopez)

En collaboration avec le groupe de JL Casanova (hopital Necker), nous avions montré que des mutations hypomorphes dans le gène codant NEMO, la sous-unité structurale/régulatrice du complexe IKK qui joue un rôle central dans la voie de signalisation NF-κB, se traduisent chez les patients mâles par une série de symptomes incluant en particulier un déficit de l'immunité innée et un syndrome appelé DEA (dysplasie ectodermale anhidrotique). Un nouveau patient a été identifié et présente des symptomes semblables, auxquels s'ajoute un déficit en cellules T mémoires. Ce patient s'est révélé porter une mutation d'une des Serines phosphoacceptrices de l'inhibiteur IκBα, ce qui bloque sa dégradation, et aboutit donc à une inhibition partielle de la voie NF-κB

Parallèlement nous avons entrepris une étude détaillée de l'activation de NF-κB par la voie du TCR. Nous avons tout d'abord montré que le complexe IKK était recruté au niveau de la synapse immunologique, puis en utilisant des cellules mutées dans divers constituants de la voie du TCR nous avons montré que le recrutement de NEMO au TCR était suffisant pour activer NF-κB. Finalement nous avons montré que le simple ciblage de NEMO à la membrane plasmique suffisait à activer NF-κB, et ceci indépendamment de sa localisation dans les redeaux lipidiques. Ce système devrait nous permettre de fractionner le mécanisme d'activation de NF-κB par le TCR en modules indépendants, et d'étudier séparément les événements NEMO-dépendants et NEMO-indépendants.

Analyse de l'activité NF-κB in vivo (S. Mémet, D. Ndiaye)

La construction de souris déficientes en deux inhibiteurs, IκBα et IκBε, a montré un phénotype nettement plus sévère que celui des souris simple KO : ces animaux meurent à la naissance et montrent une activité NF-κB augmentée, associée à une augmentation de l'expression de certains gènes-cibles. L'analyse des cellules lymphoïdes à E18,5 montre un déficit en cellules B matures, dû à une apoptose massive des cellules progénitrices. Des expériences de reconstitution dans des souris-hôtes ont identifié un rôle inattendu de NF-κB dans la migration des cellules B et T vers les organes lymphoïdes secondaires. Ces résultats confirment le rôle central de NF-κB dans l'homéostasie et la survie des lymphocytes, et suggérent qu'un déficit aussi bien qu'une augmentation de NF-κB peuvent induire des dysfonctionnements semblables.

En parallèle une approche permettant d'exprimer de manière inductible l'inhibiteur IκBα dans le cerveau antérieur a été entreprise. L'étude des neurones de ces souris a permis de confirmer pour la première fois dans un système in vivo le rôle anti-apoptotique de NF-κB dans ce type cellulaire.

Finalement une étude portant sur des neurones de cervelet en culture a permis de caractériser les voies de signalisation responsables du niveau de base d'activité NF-κB dans ces cellules, et de démontrer le rôle critique du niveau de calcium intracellulaire.

La voie de signalisation Notch (F. Logeat, C. Brou, N. Gupta, E. Six, A. Olry, P. Chastagner, D. Ndiaye)

Nous avons proposé un modèle selon lequel l'activation du récepteur Notch implique 3 étapes de maturation protéolytique. La première coupure est dûe à la furine et est nécessaire à l'expression à la membrane d'un récepteur fonctionnel. Une seconde étape de coupure, nécessaire à l'activation et dont le site est localisé dans la région extracellulaire, a été caractérisée. L'enzyme responsable a été identifiée, du moins dans certains tissus, comme étant TACE, une métalloprotéase impliquée dans la maturation du TNF. L'étape finale est dûe à une activité nommée γ-secrétase, et aboutit à la libération de la région intracellulaire du récepteur qui est transportée dans le noyau où elle se comporte comme un co-activateur transcriptionnel.

Nous nous sommes intéressés à la troisième étape de protéolyse dûe à l'activité γ-secrétase. Nous avons d'une part démontré que cette étape de clivage requérait une modification spécifique de son substrat, le produit de la seconde coupure, probablement nécessaire au transport de ce produit vers le site de coupure par la γ-secrétase. Nous avons d'autre part mis au point un crible génétique permettant d'isoler des cellules ayant perdu l'activité γ-secrétase, et qui devrait nous permettre d'identifier de nouveaux composants du complexe responsable de cette activité, ou de nouveaux régulateurs de cette activité.

Finalement nous avons montré que de manière semblable à Notch, un de ses ligands, Delta1, subissait deux coupures successives, l'une par une métalloprotéase de la famille ADAM, et la seconde par la γ-secrétase. Nous avons aussi montré que la première coupure était nécessaire à la seconde. Néamoins, contrairement à Notch, ces coupures semblent être constitutives. L'identification du site de coupure par la métalloprotéase a permis de construire une forme non-clivable du ligand. D'autre part nous avons montré que la coupure γ-secrétase libérait la région intracellulaire de Delta1, qui se retrouvait partiellement dans la fraction nucléaire. L'étude du rôle possible de cette région dans le noyau est en cours.

Mots-clés: Signalisation, phosphorylation, protéolyse, ubiquitination, NF-?B, Notch



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Marie Dominique Aytac (mdaytac@pasteur.fr) COURTOIS Gilles, INSERM (DR2)

LOGEAT Frédérique, CNRS (DR2)

BROU Christel, Institut Pasteur (Chef de laboratoire)

MEMET Sylvie, INSERM, (CR1)

WEIL Robert, CNRS, (CR1)

GUPTA Neetu, Institut Pasteur (Chargée de recherche)
BLAISE Régis, post-doc

SIX Emmanuelle, étudiante thèse

OLRY Annie, étudiante thèse

LOBRY Camille, étudiant DEA
CHASTAGNER Patricia (technicienne Pasteur)

LOPEZ Tatiana (technicienne Pasteur)

NDIAYE Delphine (AI CNRS)

MOURGUIN-NAGUIN Stéphanie (agent de laboratoire Pasteur)

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