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     Biologie cellulaire du parasitisme - INSERM U-389


  Responsable : GUILLEN-AGHION, Nancy (nguillen@pasteur.fr)


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L'amibe hématophage, Entamoeba histolytica est l'agent étiologique de l'amibiase, une maladie infectieuse intestinale responsable de 50 millions de cas cliniques et de près de 100 000 décès par an. Le parasite résidant dans le colon est doué de motilité, il envahit et détruit l'épithélium intestinal humain et forme des abcès hépatiques. L'objectif général de notre projet de recherche est d'élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués d'une part dans le mouvement de E. histolytica, et d'autre part dans son interaction avec les cellules humaines.



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Les remaniements du cytosquelette chez E. histolytica conduisent soit à la polarisation de l'amibe, qui possède alors un uroïde dans la partie postérieure et un pseudopode locomoteur dans la partie antérieure, soit à la formation de pseudopodes phagocytaires. La mise en place de ces appendices permet à E. histolytica de se déplacer et de phagocyter les cellules humaines. Nous espérons proposer un modèle de signalisation allant de la perception par l'amibe de son environnement tissulaire, à la transduction des signaux mettant en route le remodelage du cytosquelette parasitaire nécessaire à la motilité, et à l'interaction avec les cellules humaines et leur phagocytose.

1. Polarisation de E. histolytica pendant le mouvement, formation de pseudopodes et reponse chimiotaxique.

E. Labruyère, S. Blazquez avec C. Zimmer and J.C Olivo PTR-IP " Nouvelles approches pour l'étude de la polarisation moléculaire de cellules mobiles par analyse d'images quantitative " dirigé par A. Alcover.

La mobilité de E. histolytica est stimulée lors de l'invasion de tissus. Nos résultats indiquent que des cytokines humaines ont un effet chimioattractant sur E. histolytica ce qui suggère que ces molécules sont des régulateurs potentiels de la polarisation et/ou de la vitesse du mouvement. L'étude des paramètres cinétiques et morphologiques de la migration chimiotactique, in vitro, a été réalisée par analyse automatique de séquences d'images de microscopie, à l'aide d'un programme développé dans ce projet. En présence d'un gradient de TNFα, l'amibe se déforme de façon surprenante et perd la morphologie de cellules en mouvement amiboïde. Une analyse quantitative de la déformation amibienne au cours de la migration, avec et sans facteurs chimioattractant, révèle que la fraction de temps d'élongation et de rétraction est de 50% lors de la migration amibienne classique, tandis que la fraction de temps d'élongation est de 80% et celle de rétraction de 20% lors de la migration chimiotactique. Nous avons également établi que la vitesse de déplacement des amibes en présence d'un gradient de TNFα était augmentée d'un facteur 1,5 (p<0,05). Le TNFα a donc un effet chimioattractant et chimiocinétique sur E. histolytica. Ces résultats suggèrent que la présence de TNFα induit, via un récepteur amibien, une voie de signalisation affectant la dynamique et la polarisation du cytosquelette d'actine et de ces éléments régulateurs. La recherche d'une protéine amibienne fixant spécifiquement le TNFα et la mise en évidence de la voie de signalisation induite sont en cours.

2. Rôle de la motilité et de l'adhérence dans la mise en place de l'amibiase.

N. Guillén en collaboration avec M.-C. Rigothier (Faculté de Pharmacie), E. Coudrier et F. Amblard (Institut Curie) et P. Roux (Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, IP).

Nous avons observé que la lectine Gal-GalNAc, un antigène immuno-dominant qui participe à l'adhérence des amibes aux cellules épithéliales, subit le capping et est enrichi dans des microdomaines lipidiques. L'analyse cellulaire, génétique et moléculaire des fonctions de la myosine II a montré qu'elle est essentielle pour la polarité, la motilité, le capping de récepteurs en particulier celui de la lectine Gal-GalNAc. L'adhérence et la motilité de E. histolytica sauvage, et celles de souches déficientes en myosine II ou en lectine Gal-GalNAc, ont été analysées par microscopie biphotonique en temps réel. Différents environnements ont été utilisés : le verre, l'apex des entérocytes en culture et le foie entier. Nous avons montré que E. histolytica présente un mouvement regulé non-Brownian pendant la transmigration dans une monocouche d'enterocytes et dans le foie. Pour ces activités, la myosine II est essentielle. En revanche, l'adhérence due à la lectine contrôle très spécifiquement la capacité de E. histolytica à pénétrer le tissu hépatique. La transmigration des parasites à travers une monocouche d'entérocytes est en effet indépendante de cette lectine, suggérant que d'autres protéines sont nécessaires à l'interaction amibe-cellules. De plus, la souche diminuée en lectine Gal-GalNAc est propulsée par la circulation sanguine et forme de petits abcès à proximité de vaisseaux; tandis que celle diminuée dans la myosine II, est inhibée dans le processus pathogène et ne forme pas d'abcès. Les facteurs de régulation de ces phénotypes sont à l'étude.

3. Analyse cellulaire et biochimique de l'interaction entre E. histolytica et les cellules de l'hôte.

M. Seigneur, Julien SantiRocca. Projet soutenu par le Projet PHAGOAMEBA, Union Européenne - INCO-DEV

La mise en place d'une interaction amibe - cellule hôte constitue la première étape de l'invasion des tissus par E. histolytica. Lors de l'interaction amibe-entérocyte, la mise en place de mécanismes d'adhérence s'accompagne de changements drastiques au niveau du cytosquelette des cellules cibles. Les microfilaments sont délocalisés et des remaniements membranaires des entérocytes sont induits. Les amibes pénètrent par la suite dans la monocouche de cellules. L'analyse approfondie de l'interaction amibe-entérocytes révèle qu'en dehors de la lectine Gal-GalNAc d'autres protéines se lient à l'apex des entérocytes. Par chromatographie d'affinité avec la bordure en brosse des entérocytes, nous avons mis en évidence plusieurs protéines amibiennes. Parmi celles-ci deux protéines basiques riches en lysines (25% K) et en acide glutamique (19 et 14% E) ont été trouvées : KERP-1 et KERP-2. Contrairement à KERP-2, KERP-1 ne présente pas d'homologue chez E. dispar, une espèce non-pathogène très proche d'E. histolytica, suggérant un rôle dans le processus pathogène. L'analyse de KERP-1 nous a montré (i) qu'elle se localise à la membrane plasmique et dans des vésicules de l'amibe, (ii) que sa concentration est accrue au cours de la formation d'abcès hépatique chez le hamster avec une relocalisation à la périphérie de l'amibe, (iii) que sa concentration décroît au cours du temps lors de la mise en culture axenique de trophozoïtes extraits d'un abcès hépatique de hamster. Ces résultats nous indiquent que KERP-1 participe au processus pathogène d'E. histolytica, et son rôle soit dans la virulence et/ou dans la protection des amibes face aux cellules hôtes sera déterminé. Enfin, ses caractéristiques font de KERP-1 un bon candidat pour le diagnostic spécifique d'E. histolytica et un brevet a été déposé dans ce sens.

4. Dynamique du cytosquelette pendant la phagocytose chez E. histolytica

S. Marion en collaboration avec C. Laurent-Winter, (PT-Protéomique, IP), C. Whilem et F. Gazeau (Université Paris VII). Projet PHAGOAMEBA, Union Européenne - INCO-DEV.

La phagocytose des cellules humaines est un phénomène majeur pendant l'amibiase. Elle est amorcée grâce aux récepteurs de surface amibiens qui reconnaissent des ligands localisés sur les cellules cibles, le signal déclenché active des remaniements du cytosquelette. Plusieurs protéines du cytosquelette, ou régulant son activité, participent à la formation des pseudopodes pendant la phagocytose. Certaines de ces protéines ont déjà été identifiées dans notre laboratoire : l'actine, Rac1, PI3-Kinase, ABP-120, la myosine IB et le complexe Arp2/3. Une souche qui surexprime le gène codant la myosine IB a été fabriquée et nous avons montré, par mesure de la viscoélasticité du cytoplasme, que son cytosquelette d'actine est plus dense et moins flexible, un fait qui corrèle avec un retard dans l'initiation du processus de phagocytose. A l'aide de souches déletées pour différents domaines fonctionnels de la myosine IB, nous avons montré que la présence simultanée des deux sites liant l'actine est nécessaire à ce phénotype. Ces résultats suggèrent que dans les cellules au repos, la myosine IB joue le rôle d'un "cross-linker" des filaments d'actine et que cette activité est impliquée dans les propriétés mécaniques des gels cytoplasmique et cortical. Une observation en microscopie électronique du réseau tri-dimensionnel d'actine sous-corticale est en cours afin de visualiser les changements structuraux induits par la surexpression de la myosine IB.

D'autre part, par imagerie quantitative, nous avons observé que lors de l'extension des pseudopodes, la myosine IB semble induire la polymérisation "de novo" de filaments d'actine. Cette fonction pourrait être médiée par le domaine SH3 de la myosine IB. La recherche de régulateurs de cette activité, ainsi que d'effecteurs de la myosine IB, nous a conduit à l'analyse, en électrophorèse bidimensionnelle, des protéines recrutées au stade de la vacuole phagocytaire. La comparaison avec les protéines présentes au stade plus tardif de phagosome clos, nous permettra l'identification des protéines spécifiquement recrutées pendant la signalisation induite après liaison du récepteur amibien avec la cellule cible à phagocyter.

5. Analyse génétique du processus pathogène de E. histolytica par l'approche RNA i.

L. Vayssié-Niger en collaboration avec M. Vargas (CINVESTAV, Mexique). Projet PHAGOAMEBA, Union Européenne - INCO-DEV.

Afin d'étudier le processus pathogène de E. histolytica nous avons mis au point la technique d'extinction de fonctions de gènes par interférence des ARN spécifiques (RNAi). Le gène codant la γ-tubuline a été choisi car cette protéine est responsable de fonctions essentielles dans toute cellule eucaryote. Les ARN double brin ont été produits par des bactéries qui sont phagocytées par l'amibe. Alternativement, des petits ARN spécifiques et complémentaires de la séquence en nucléotides ont été synthétisés et éprouvés. Les deux démarches se sont avérées fructueuses. Le réseau microtubulaire intranucléaire disparaît chez les amibes traitées par RNAi. Ainsi, la γ-tubuline apparaît comme un régulateur du réseau microtubulaire chez E. histolytica.

6. Analyse de la virulence de E. histolytica à l'aide du transcriptome

C. Weber, en collaboration avec M.-C. Rigothier (Faculté de Pharmacie), D. Mirelman (Institut Weizmann, Israel) et L. Frangeul, JY Coppée et C. Gouyette (Genopole, IP). Projet soutenu par Pasteur-Weizmann Research Council.

Pour identifier les gènes spécifiquement activés lors de la mise en route de l'invasion des tissus par E. histolytica, l'analyse de transcrits amibiens par une approche " transcriptome " a été démarrée. Une banque différentielle enrichie en transcrits issus d'amibes isolées d'abcès hépatique ainsi qu'une banque de cDNA ont été construites et séquencées. Le regroupement des séquences obtenues a produit un ensemble contenant 1500 séquences uniques. Ces séquences ont été validées par bioinformatique et constituent le premier ensemble de transcrits de E. histolytica utilisés dans la réalisation d'une puce à ADN. Pour mettre au point les conditions d'exploration de puces, un ensemble de 100 gènes a été sélectionné, ainsi que des gènes de normalisations. Des nucléotides de 70 bases ont été synthétisés à la Génopole de l'IP. Une première "Puce 100" d'essai a été réalisée et elle nous a permis de valider la démarche experimentale. Des ARN messagers des amibes sauvages ou déficientes dans les fonctions du cytosquelette, ou de la lectine Gal-GalNAc, ou de l'amebapore, permettront le criblage de ces puces.

La réalisation de la "Puce 1500" et son utilisation devrait débuter au début de l'année 2004

Mots-clés: amibiase, cytosquelette, adhérence, Entamoeba, imagerie, mobilité



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Lambrecht, Marie-Régine, lambrech@pasteur.fr Guillén-Aghion, Nancy. Directeur de Recherche CNRS. nguillen@pasteur.fr

Labruyère-Dadaglio, Elisabeth. Chargée de Recherche, I.P.

Seigneur, Marie. Chargée de Recherche, INRA
Vayssié-Niger, Laurence. Post-Doctorant EU.

Marion, Sabrina. Etudiante en thèse de Doctorat.

Blazquez, Samantha. Etudiante en thèse de Doctorat.

Santi-Rocca, Julien. Etudiant D.E.A.
 

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